تقدير عدد الخلايا العصبية الدوبامين في نيجرا substantia هو مقياس النتيجة الرئيسية في أبحاث مرض باركنسون. هذا البروتوكول يقلل بشكل كبير من عبء العمل المطلوب لتقدير عدد الخلايا العصبية. توفر هذه الطريقة عملية فعالة ودقيقة من حيث الوقت للكشف عن التغيرات في عدد الخلايا العصبية الدوبامين ومناسبة لتحديد تأثير التدخلات على بقاء الخلية.
ويمكن تكييف هذه الطريقة بسهولة لتوفير عدد دقيق من الخلايا العصبية في مناطق الدماغ المختلفة مع الحفاظ على مزايا التكلفة والوقت على الطرق التقليدية stereological. لالتقاط صور IHC استخدام البرنامج إلى جانب المجهر confocal في التكبير 10X. افتح ثقب الدبوس إلى 1.5 وحدة منطقة لالتقاط طائرة واسعة يبلغ مجموعها 1.5 متر صغير وتعيين التركيز على الجانب المحقون من الدماغ.
في علامة التبويب اكتساب تحقق من خيار التصوير مسح البلاط وتعيين الأبعاد إلى 10 في أربعة. ضمن لوحة وضع الاستحواذ تعيين التكبير إلى 1.1 لتجنب أي علامات خياطة بين الصور مسح البلاط. تعيين حجم الإطار إلى 1024 من قبل 1024 بكسل ومتوسط إلى اثنين لضمان الحصول على صورة عالية الجودة.
في لوحة القنوات تعيين المسار الأول إلى اليكسا 488 وتتبع اثنين إلى اليكسا 555. تحميل الشريحة على خشبة المسرح واختيار قسم مع تلطيخ TH قوية. انقر على الهواء مباشرة على لوحة الاستحواذ.
في لوحة القنوات تعيين قوة الليزر والحصول على المستويات التي تزيد من إشارة والحد من الضوضاء الخلفية. استخدم مؤشر النطاق لضمان عدم تعريض الإشارات بشكل مفرط. كرر ذلك باستخدام شرائح متعددة.
في علامة التبويب الاستحواذ حدد خانة الاختيار المواضع. لبدء التصوير، استخدم قطعة العين واختر القسم الأول الذي يظهر تلطيخ TH الإيجابي. ثم تعيين التركيز في نقطة الاهتمام ونقل المرحلة إلى خط الوسط من المقطع.
وهذا يحفظ الموضع في محاور X و Y و Z وسيتم تصوير مسح تجانب التقاط المقطع بأكمله. كرر ذلك لجميع الشرائح الأخرى بما في ذلك موقع غير المحقون. ملفات صور منفصلة باستخدام البرامج المناسبة واستيرادها إلى برنامج تحليل الصور الآلي.
تحديد منطقة الاهتمام عن طريق تحديد أداة التعليق القلم لرسم تعليق توضيحي حول substantia nigra pars compacta. الانتقال إلى علامة التبويب تحليل وحدد ضبط الوقت الحقيقي من القائمة المنسدلة تحليل. يفتح هذا إطار منفصل على صورة المقطع مما يسمح بتعديل معلمات التحليل في الوقت الفعلي.
ضمن قسم تكبير التحليل حدد تكبير الصورة المناسب. تحت قسم الكشف عن الخلية حدد الصبغة النووية كصبغة تستخدم لتلطيخ TH. ضبط عتبة التباين النووي، والحد الأدنى من الكثافة النووية، وعدوانية التقسيم النووي وإعدادات الحجم النووي مع مراقبة نافذة ضبط الوقت بعناية.
كرر هذه العملية مع عينات متعددة. بمجرد أخذ عينات من عدد مناسب من الصور وتعديل الضبط في الوقت الفعلي وفقا لذلك حفظ إعدادات التحليل في القائمة المنسدلة إجراءات الإعدادات. حدد جميع الصور التي سيتم تحليلها وانقر على تحليل.
اختر إعداد التحليل الذي تم حفظه للتو وفي منطقة نافذة التحليل تحقق من مربع طبقات التعليقات التوضيحية ، ثم تحقق من الطبقة الأولى وانقر على التحليل. بمجرد الانتهاء من تصدير بيانات التحليل الموجز لجميع المقاطع عن طريق تحديد خيار تصدير بيانات تحليل الكائن. يمكن استخدام مجموعة البيانات هذه لفحص التغيرات في حجم الخلية استجابة للسموم أو العلاجية.
بعد ستة أسابيع من حقن الفيروس المرتبطة أدينو أو AAV، أدى الحقن المجسمة من AAV التعبير عن متحولة A53T ألفا سينوكلين في نيجرا substantia في دماغ الفئران في انخفاض كبير في كثافة الخلايا العصبية الدوبامين. انخفض متوسط عدد الخلايا العصبية الإيجابية TH لكل ملليمتر مربع في نيغرا substantia من الفئران التي تم حقنها مع AAV-A35T بشكل كبير بالمقارنة مع الفئران التي تم حقنها مع ناقلات فارغة AAV. وقدمت ملاحظات مماثلة باستخدام مجسمة غير متحيزة.
عند محاولة هذا البروتوكول نضع في اعتبارنا البرنامج هو فقط مفيدة كما هو مدرب على أن يكون. لذلك يجب أخذ الوقت والعناية لضمان تحديد خلية واحدة كخلية واحدة. يمكن تكييف البرنامج لقياس كثافة الفلورسينس من البروتينات الأخرى ذات الاهتمامات مثل ألفا سينوكلين لتحديد ما إذا كانت العلاجات يمكن أن تعدل مستويات البروتين.
وقد سمحت هذه التقنية لمزيد من الكفاءة عند اختبار تأثير العلاجات المحتملة متعددة على كثافة الخلايا العصبية الدوبامين.
