该手术的总体目标是在动物模型中重现帕金森病的大部分基本方面。腺相关病毒载体的立体定位递送，编码黑质中的人突触核蛋白。帕金森病是一种神经退行性疾病，涉及黑纹体通路中多巴胺能神经元的死亡，从而导致自主运动失控的进展。
这种神经退行性过程伴随着大脑中蛋白质聚集体的沉积，其主要由突触核蛋白构成。新的证据表明，突触核蛋白聚集体可以刺激小胶质细胞上的 Toll 样受体，从而引发黑质中的神经炎症。此外，有证据表明，突触核蛋白聚集体可以通过抗原呈递细胞到T细胞来捕获和呈递，诱导突触核蛋白特异性的适应性免疫反应。
在黑质中编码人突触核蛋白的腺相关病毒载体的立体定位递送已被证明可以再现该疾病的许多基本方面，包括突触核蛋白病理学，小胶质细胞活化，T细胞活化，神经变性和运动障碍。本研究分析了病毒载体和病毒载体递送后的时间如何影响黑质中人突触核蛋白表达、神经变性和神经炎症的程度，以及黑质中人突触核蛋白单侧立体定位递送小鼠模型中的运动损伤程度。为了保持无菌环境，在整个手术过程中穿戴适当的手术服，包括鞋套，手术口罩，卫生屏障，手套和手术帽。
将乙醇喷洒在小鼠和所有手术材料上，以保持无菌环境。为了诱导镇痛，每12小时皮下注射卡洛芬，从手术前一小时开始，持续到手术后三天。为了麻醉小鼠，将动物置于诱导室中。
以0.5%的速率打开异氟醚流量，然后在大约五分钟内缓慢增加至5%，直到小鼠失去其矫正反射。将动物从诱导室中取出。立即将动物转移到具有适当大小的鼻锥的非再呼吸回路中。
维持小鼠麻醉，在整个手术过程中使用异氟醚1%。通过捏住鼠标的尾巴和爪子来确认鼠标完全麻醉。当鼠标在捏尾巴和爪子时没有反应时，这意味着鼠标被完全麻醉了。
用剪刀剃掉鼠标头。使用含有氯己定2%的棉签清洁小鼠皮肤，并去除所有毛发。将鼠标头固定在立体定位框架中。
使用棉签将角膜保护剂放在小鼠双眼中。为了防止其他啮齿动物的压力诱导，避免手术室中存在任何其他小鼠。用三轮氯己定2%清洁小鼠头部，然后用乙醇70%用手术材料暴露颅骨，并用钻头在坐标前后2.8毫米和中外侧1.4毫米处相对于内侧线做一个薄孔。
将10微升注射器的针头放入孔中，并将针头缓慢移动到大脑内，直到到达7.2毫米背腹，相对于硬脑膜。将针头放在最后位置两分钟，让组织稍微沉降，然后以每30秒0.2微升的速度将一微升病毒载体注射到右黑质中。在递送病毒载体后将针头保持在相同位置五分钟，然后缓慢取出。
使用无菌丝缝合线闭合伤口。将鼠标放在家庭笼子里，通过将其放在电动保暖床垫上进行预热。立体定向手术后12周，评估运动性能，使用简化版本的光束测试，如前所述。
为此，请使用长度为 25 厘米、宽度为 3 厘米的水平横梁。光束表面必须由金属网格覆盖，其正方形为一厘米，并在光束上方抬高一厘米。制作鼠标的视频，同时遍历网格表面光束，从光束的一端到另一端，即家庭笼子所在的位置。
训练鼠标两天，然后确定电机性能。在第一天，训练鼠标在没有网格的情况下穿过光束五次。第二天，训练鼠标穿过光束，在网格存在的情况下五次。
第三天，评估电机性能。为此，请量化左爪或右爪分别通过慢动作观看视频来执行的错误数量。为了麻醉小鼠，腹腔内注射氯胺酮和甲苯噻嗪的混合物。
一旦小鼠完全麻醉，用手术材料打开胸部，露出心脏。然后将扁平尖端针插入心脏的左心室。通过将针头连接到管道上，使用蠕动泵以每分钟9.5毫升的速度灌注50毫升磷酸盐缓冲盐水。
使用剪刀和镊子去除大脑，然后浸泡在五毫升4%多聚甲醛中，在磷酸盐缓冲盐水中固定。之后，将固定的大脑，在15毫升30%蔗糖中放置48小时。然后将大脑放入四毫升的冷冻保护液中，并将大脑保存为80度，或者在下一步中立即使用。
为了获得纹状体切片，将大脑切成40微米厚的部分，从1.34毫米开始，到0.26毫米结束。按照前后顺序，在两毫升的冷冻管中收获每片。为了在纹状体中进行免疫组化和免疫荧光分析，请选择以均匀间隔采集的五个冠状纹状体切片，这些切片覆盖了细胞核的整个卵管膽度。
为了验证病毒载体在黑纹体通路的多巴胺能神经元中的正确递送，在黑质中注射编码GFP的载体，12周后，通过免疫荧光分析黑质和纹状体中的GFP荧光和酪氨酸羟化酶免疫反应性。GFP相关荧光仅位于同侧位点，并且在黑质和纹状体中均观察到酪氨酸羟化酶免疫反应性的显着共定位，表明病毒载体在黑质纹状体通路的多巴胺能神经元中的正确递送。为了测试载体的剂量，编码突触核蛋白，诱导促进黑粒多巴胺能神经元神经变性的人类突触核蛋白的显着过表达，注射不同剂量的载体。
12周后，在黑纹状体通路中测试人突触核蛋白免疫反应性和酪氨酸羟化酶免疫反应性的程度。人突触核蛋白免疫反应性明显，所有剂量均在黑质中进行测试。然而，每只小鼠仅接受10至10个病毒基因组的小鼠，在纹状体中表现出明显的人突触核蛋白免疫反应性。
每只小鼠接受10至10个病毒基因组的小鼠编码人突触核蛋白的载体，在黑质中显示出多巴胺能神经元的显着损失。尽管接受相同剂量编码GFP的载体的小鼠表现出低程度的神经元损失，但与那些接收编码人类突触核蛋白的载体的小鼠相比，这些小鼠表现出显着较低的神经变性程度。使用光束测试，仅在这些小鼠中检测到运动性能的显着降低，当比较右爪和左爪的错误数量时，或者当比较接收编码人类突触核蛋白的载体的小鼠的错误总数时，每只小鼠接收编码人类突触核蛋白的载体的10至10个病毒基因组， 与那些接受对照载体的小鼠。
为了确定人突触核蛋白表达的开始，用每只小鼠10至10个病毒基因组治疗小鼠，编码人突触核蛋白的载体或假手术，并在立体定位手术后的第二至第五周内，在黑质中分析人突触核蛋白表达的程度，每周一次。结果表明，人类突触核蛋白表达在立体定位手术后第五周开始显现。为了确定小胶质细胞活化的峰值，在手术后的第2-15周，在小鼠纹状体中定量表达高水平Iba1的细胞的程度。
结果显示，与小鼠的对侧相比，病毒接种后15周，同侧的小胶质细胞活化显着增加。在不同时间点分析浸润到实质性黑鬼中的调节性T细胞的数量，在立体定位手术后通过免疫荧光，然后进行共聚焦显微镜观察。在手术后第11周观察到调节性T细胞浸润到黑质中的峰值。
这里分析的神经变性小鼠模型代表了研究帕金森病病理生理学中关键方面参与数量的有用模型。参与突触核蛋白病理学、小胶质细胞活化、外周免疫系统参与神经炎症和神经变性的机制 适当剂量的腺相关病毒载体，编码人突触核蛋白诱导神经变性、神经炎症、T细胞浸润和运动损伤的5型病毒是每只小鼠10至10个病毒基因组。这项研究表明，在立体定位手术后五周，构成了一个关键的时间点，其中人类突触核蛋白的表达已经很明显，但在这个动物模型中没有运动障碍。
因此，这个时间点，代表了一个有趣的时间点，开始施用实验疗法来量身定制，以阻止神经炎症和神经变性的进展。在这个动物模型中，分析神经炎症的最合适的时间点是立体定位手术后的第15周。同时是分析T细胞浸润到中枢神经系统的适当时间点。
似乎在病毒载体接种后的第 11 周。
