Substantia nigrada dopaminerjik nöron sayısının tahmin edilmesi Parkinson hastalığı araştırmalarında önemli bir sonuç ölçüsüdür. Bu protokol, nöron sayısını tahmin etmek için gereken iş yükünü önemli ölçüde kısaltır. Bu yöntem, dopaminerjik nöron sayısındaki değişiklikleri tespit etmek için zaman verimli ve doğru bir süreç sağlar ve müdahalelerin hücre sağkalımı üzerindeki etkisini belirlemek için uygundur.
Bu yöntem, geleneksel stereolojik yöntemlere göre maliyet ve zaman avantajlarını korurken, farklı beyin bölgelerindeki nöronların doğru sayılarını sağlamak için kolayca uyarlanabilir. IHC görüntülerini yakalamak için yazılımı 10X büyütmede bir konfokal mikroskopla birleştirilmiş olarak kullanın. Toplam 1,5 mikro metre geniş bir düzlemi yakalamak için pim deliğini 1,5 alan birimine açın ve odağı beynin enjekte edilen tarafına ayarlayın.
Edinme sekmesinde döşeme tarama görüntüleme seçeneğini işaretleyin ve boyutları 10'a dört olarak ayarlayın. Alma modu panelinin altında, döşeme tarama görüntüleri arasında dikiş işareti olmaması için yakınlaştırmayı 1,1 olarak ayarlayın. Yüksek kaliteli görüntü alımını sağlamak için çerçeve boyutunu 1024 x 1024 piksel ve ortalamayı ikiye ayarlayın.
Kanallar panelinde bir parçayı Alexa 488'e ve ikinci parçayı Alexa 555'e ayarlayın. Slaydı sahne alanına yükleyin ve güçlü bir TH boyamaya sahip bir bölüm seçin. Satın alma panelinde canlı olarak tıklayın.
Kanallar panelinde lazer gücünü ve kazancını sinyali en üst düzeye çıkaran ve arka plan gürültüsünü sınırlayan seviyelere ayarlayın. Sinyallerin aşırı pozlanmamasını sağlamak için aralık göstergesini kullanın. Bunu birden çok slaytla tekrarlayın.
Edinme sekmesinde pozisyonlar kutusunu işaretleyin. Görüntülemeye başlamak için göz parçasını kullanın ve pozitif TH lekesi gösteren ilk bölümü seçin. Ardından odağı ilgi çekici noktaya ayarlayın ve sahneyi bölümün orta çizgisine taşıyın.
Bu, X, Y ve Z eksenlerindeki konumu kaydeder ve tüm bölümü yakalayan bir döşeme taraması görüntüler. Eklenmemiş bir site de dahil olmak üzere diğer tüm slaytlar için bunu yineleyin. Uygun yazılımı kullanarak görüntü dosyalarını ayırıp otomatik görüntü analiz yazılımına aktarın.
Substantia nigra pars compacta'nın etrafına ek açıklama çizmek için kalem ek açıklama aracını seçerek ilgi çekici bir bölge tanımlayın. Analiz sekmesine gidin ve açılır çözümleme menüsünden gerçek zamanlı ayarlamayı seçin. Bu, bölüm görüntüsünde analiz parametrelerinin gerçek zamanlı olarak değiştirilmesine izin sağlayan ayrı bir pencere açar.
Analiz büyütme bölümünün altında uygun görüntü yakınlaştırmayı seçin. Hücre algılama bölümünün altında TH boyama için kullanılan boya olarak nükleer boyayı seçin. Zaman ayarlama penceresini dikkatle izlerken nükleer kontrast eşiğini, minimum nükleer yoğunluğu, nükleer segmentasyon agresifliğini ve nükleer boyut ayarlarını yapın.
Bu işlemi birden çok örnekle tekrarlayın. Uygun sayıda görüntü örneklendikten ve gerçek zamanlı ayarlama buna göre ayarlandıktan sonra, analiz ayarlarını ayarlar eylemleri açılır menüsüne kaydedin. Analiz edilecek tüm görüntüleri seçin ve analize tıklayın.
Yeni kaydedilmiş analiz ayarını seçin ve analiz penceresinde ek açıklama katmanları kutusunu işaretleyin, sonra birinci katmanı işaretleyin ve çözümle'yi tıklatın. Nesne çözümleme verilerini dışa aktarma seçeneğini belirleyerek tüm bölümlerin özet çözümleme verilerini dışa aktarmayı tamamladıktan sonra. Bu veri kümesi, bir toksine veya terapötik yanıt olarak hücre boyutundaki değişiklikleri incelemek için kullanılabilir.
Adeno ilişkili virüs veya AAV enjeksiyonlarından altı hafta sonra, sıçan beynindeki substantia nigra içine mutant A53T alfa sinükleini ifade eden AAV'nin stereotaktik enjeksiyonu dopaminerjik nöronların yoğunluğunda önemli bir azalmaya neden oldu. AAV-A35T enjekte edilen sıçanların substantia nigra'sında kare başına ortalama TH pozitif nöron sayısı, AAV boş vektörü ile enjekte edilen sıçanlara kıyasla önemli ölçüde azaldı. Benzer gözlemler tarafsız stereology kullanılarak yapılmıştır.
Bu protokolü denerken, yazılımın yalnızca eğitilmiş olduğu kadar yararlı olduğunu unutmayın. Bu nedenle tek bir hücrenin tek bir hücre olarak tanımlanmasını sağlamak için zaman ve özen verilmelidir. Yazılım, tedavilerin protein seviyelerini modüle edip edep gösteremeyeceği belirlemek için alfa-sinüklein gibi diğer ilgi alanlarının floresan yoğunluğunu ölçmek için uyarlanabilir.
Bu teknik, birden fazla potansiyel terapötikin dopaminerjik nöron yoğunluğu üzerindeki etkisini test ederken daha fazla verimlilik sağladı.
