猪角膜组织外植研究单纯疱疹病毒-1抗病毒药物的功效

了解药物在动物模型中的疗效是成本和劳动密集型。我们使用前体内组织外植模型的协议在进行研究所需的成本和科学人员方面都显著降低。这项技术的主要优点是使用猪眼，与其他一些小型动物模型相比，猪眼的解剖学和生理学与人眼非常相似。

当我们在体外测试药物时，它们可能显示出在动物或人类模型中可能不存在的疗效。前体内组织系统是了解我们的体外系统是否可以转化为动物和人体试验的最佳方法。猪角膜系统虽然劳动密集程度较低，但需要训练有素的技能来分离、维持、感染和治疗药物，特别是将角膜与整个猪眼隔离的过程很难用语言来表达，但需要视觉演示。

从合适的供应商处接收猪眼后，将组织储存在冰上直到加工，并放置适当的个人防护设备。用 70% 乙醇对工作区域进行消毒，并在工作空间上固定一个长凳盖。当工作区域准备就绪时，将眼睛放在50毫米的纱布上，用纱布一只手抓住后部。

使用30度针头，小心地在眼睛上皮表面的大约中心进行一次穿刺，注意不要损坏频闪，并用锋利的绝育刀片在离角膜一毫米远的硬囊上做一个小切口。使用快速和光滑的手旋转动作，并注意，球形幽默不泄漏，切开角膜的边缘，并用扁平的钳子将角膜固定在角膜边缘，使用刀片切断剩余的系绳膜。当每个角膜被分离时，将组织面朝上放入每个井中含有两毫升角膜介质的12井板的单独井中，并在每个角膜表面的脱布里部位增加5个5倍10的微升，加入17个GFP病毒溶液的第五块斑块形成单元。

收集完所有角膜后，将板材放入37摄氏度、5%的二氧化碳孵化器中72小时，并用10%的漂白剂喷洒实验中未使用的任何额外眼睛，将其安全地处理在生物危害袋中。每天在添加药物之前，将角膜板置于立体显微镜下，并选择 GFP 过滤器和 500 微秒的暴露时间。捕捉图像在最低放大倍率之前成像角膜在一系列增加的放大倍率，直到所有的病毒传播和树突形成可以清楚地可视化。

当所有的角膜都被成像时，将板返回到组织培养孵化器。感染前一天，用每口10毫升PBS清洗两次汇流病毒细胞培养，并在37摄氏度下用每口井0.05%的1毫升试金石治疗细胞5至10分钟。当细胞分离后，使用整个介质的9毫升，以确保细胞完全从烧瓶表面脱落，并将产生的细胞悬浮转移到15毫升离心机管。

将300微升细胞加入到新六井板的每口井中，然后向每口井添加两毫升中等，然后将板放在细胞培养孵化器中过夜。第二天早上，为了从每个角膜中收集病毒进行量化，在生物安全柜中的多个微中心管中将无菌棉签尖浸泡在500微升无血清介质中，至少5分钟。在孵化结束时，小心地将受感染的猪角膜培养物放入柜子中。

使用湿棉签，顺时针进行三次旋转，从每个受感染的猪角膜中心逆时针旋转三圈，不施加过大的压力。在一系列革命的结尾，在无血清介质中顺时针和逆时针将每个拭子旋转五次，然后切割拭子，使尖端适合每个带盖子的管内。当所有的角膜都被擦拭时，以高速涡流管一分钟。

要量化从每个角膜中收集的病毒量，请在微中心管中的无血清介质中准备病毒的日志101倍稀释，直到稀释10倍至负8。从每口细胞井中吸气生长介质后，将每口病毒稀释的一毫升从10倍转移到负3到镀细胞单层，并将受感染的细胞放入细胞培养孵化器中两小时。在孵化结束时，用PBS轻轻清洗每口井两次，然后向每口井加入两毫升甲基纤维素介质，进行72小时的孵化，或直到观察到斑块的形成。

观察斑块后，在每个井的一角慢慢加入一毫升甲醇，在室温下孵育15分钟。在孵化结束时，慢慢地从每口井中吸出内容，而不会干扰细胞单层。接下来，用一毫升的水晶紫罗兰工作溶液给每口井贴上标签，注意所有细胞都覆盖在30分钟的潜伏期内，不受光线的照射。

在孵化结束时，丢弃溶液，在吸水纸上干燥油井，然后计算最高稀释井的斑块数量，以三次量化起始溶液中的总病毒含量。正如这种立体荧光成像分析所观察到的，BX795的抗病毒功效与TFT在控制病毒传播方面相似，而用车辆治疗的角膜仅在初始病毒接种后六天内证明病毒从中央感染区传播到外围。同样，在感染后的第2天和第4天采集的眼拭子在阳性对照和BX795处理的样本中表现出对病毒的完全抑制，而在阴性控制样本中观察到感染性病毒滴答声的急剧增加。

将猪角膜与整个猪眼隔离是最重要的一步。步骤 2.3 到 2.6 是此过程中最关键的步骤。我们的模型可用于了解病毒在猪角膜中的树突传播。

这种方法也可以扩展到细菌和真菌感染。这种方法有助于可视化病毒在人类模型外的角膜中的树突传播。该模型有助于在进行动物和人体试验之前测试药物的功效。