동물 모델에서 약물의 효능을 이해하는 것은 비용과 노동 집약적입니다. 전 생체 조직 각성 모델을 사용하는 우리의 프로토콜은 연구를 수행하는 데 필요한 비용과 과학 인력 모두에서 크게 낮습니다. 이 기술의 주요 장점은 다른 작은 동물 모델과 는 달리 해부학 및 생리학이 인간의 눈과 매우 유사한 돼지 눈의 사용입니다.
우리가 체외에서 약물을 테스트 할 때, 그들은 동물 이나 인간의 모델에 없을 수 있습니다 효능을 표시할 수 있습니다. Ex vivo 조직 시스템은 우리의 체외 시스템이 동물 및 인체 실험으로 변환 될 수 있는지 여부를 이해하는 가장 좋은 방법입니다. 돼지 각막 시스템은 노동 집약적이지만 약물로 분리, 유지, 감염 및 치료할 수 있는 훈련 가능한 기술이 필요하며, 특히 전체 돼지 눈에서 각막을 분리하는 과정은 말로 표현하기 는 까다롭지만 시각적 인 데모가 필요합니다.
적합한 공급 업체로부터 돼지 눈을 받으면 처리 될 때까지 조직을 얼음에 보관하고 적절한 개인 보호 장비를 착용하십시오. 작업 영역을 70%에탄올로 소독하고 작업 공간에 벤치 커버를 고정합니다. 작업 영역이 준비되면 50밀리미터 의 거즈 조각에 눈을 놓고 거즈를 사용하여 한 손으로 후방 섹션을 잡습니다.
30 게이지 바늘을 사용하여, 조심스럽게 눈의 상피 표면의 중심에 하나의 펑크를 만들고, 스트로마를 손상시키지 않도록주의하고, 각막에서 1 밀리미터 거리에서 clera에 작은 절개를 만들기 위해 날카로운 살균 블레이드를 사용합니다. 손의 신속하고 부드러운 회전 작용을 사용하여 유리악 유머가 누출되지 않도록주의하고, 각막의 가장자리를 잘라 평평한 트위저로 각막 가장자리를 잡고, 나머지 테더링 멤브레인을 잘라 블레이드를 사용합니다. 각막이 고립됨에 따라, 조직을 12웰 플레이트의 개별 우물로 배치하여 각막 매질의 2밀리리터를 함유하고 각막 표면의 디스브라이드 부위에 17GFP 바이러스 용액의 5배 10번의 마이크로리터를 5배 10번 의 마이크로리터를 추가한다.
모든 각막을 채취하면 플레이트를 섭씨 37도, 이산화탄소 인큐베이터 5%를 72시간 동안 넣고 실험에 사용하지 않는 추가 눈을 10%의 표백제로 분사하여 생물학적 위험에 드는 가방에 안전하게 처리합니다. 약물을 첨가하기 전에 매일 각막 판을 스테레오 현미경으로 놓고 GFP 필터와 500 마이크로초 노출 시간을 선택합니다. 모든 바이러스 확산 및 수상자 형성이 명확하게 시각화 될 때까지 증가 배율의 시리즈에서 각막을 이미징하기 전에 가장 낮은 배율에서 이미지를 캡처합니다.
각막의 모든 이미지가 이미지되었을 때, 조직 배양 인큐베이터에 접시를 반환합니다. 감염 전날, 세척당 PBS 10 밀리리터로 컨물린 베로 세포 배양을 두 번 세척하고, 섭씨 37도에서 5~10분 동안 잘 1밀리리터당 0.05%의 트립신으로 세포를 치료한다. 세포가 분리되면 전체 배지의 9 밀리리터를 사용하여 세포가 플라스크 표면에서 완전히 빠져나와 결과 세포 현탁액을 15 밀리리터 원심분리기로 전달합니다.
300 마이크로리터의 셀을 새로운 6개의 웰 플레이트에 넣고, 그 다음에 각각 의 양산에 2밀리리터를 첨가한 다음 하룻밤 동안 세포 배양 배양에 플레이트를 놓습니다. 다음 날 아침, 각 각막에서 바이러스를 수집하여 정량화를 위해, 멸균 면봉 팁을 생물 안전 캐비닛에 여러 마이크로센티심심분리기 튜브에 봉제당 500 마이크로리터에 500마이크로리터를 흡수하여 최소 5분간 생체 안전 캐비닛에 넣습니다. 인큐베이션의 끝에, 조심스럽게 캐비닛에 감염된 돼지 각막 문화를 배치.
젖은 면봉을 사용하여 시계 방향으로 3개의 회전을 만들고, 과도한 압력을 가하지 않고 감염된 각막의 중심에서 시계 방향으로 5밀리미터 의 세 가지 회전을 만듭니다. 일련의 회전이 끝나면 각 면봉을 세럼이 없는 중간 크기의 마이크로센트리슈에이체 튜브를 시계 방향으로 5번 회전한 후 면봉을 절단하여 뚜껑이 닫혀 있는 각 튜브 에 팁이 들어갈 수 있도록 합니다. 각막이 모두 스왑되었을 때 튜브를 1 분 동안 고속으로 소용돌이시킵니다.
각 각막에서 수집된 바이러스의 양을 정량화하기 위해, 10배에서 음수 8로 1회 희석될 때까지 마이크로센트심분리기 튜브내혈청 이질이 없는 배지에서 바이러스의 1배 희석을 준비한다. 세포의 각 우물에서 성장 배지를 흡수 한 후, 각 바이러스 희석의 1 밀리리터를 10번에서 음수 3개로 도금 된 세포 단층으로 옮기고 감염된 세포를 세포 배양 배양에 2 시간 동안 배치한다. 인큐베이션의 끝에서, 부드럽게 72 시간 배양 또는 플라크의 형성이 관찰 될 때까지 각 우물에 메틸 셀룰로오스 라덴 매체의 두 밀리리터를 추가하기 전에 PBS와 함께 각각 두 번 잘 세척한다.
플라크 관찰 시, 실온에서 15분 간 배양하기 위해 각 우물 구석에 메탄올 1밀리리터를 천천히 넣습니다. 인큐베이션의 끝에서, 천천히 세포 단층을 방해하지 않고 각 우물에서 내용을 흡인. 다음으로, 모든 세포가 빛으로부터 보호되는 30분 간 잠복이 보장되는 것을 주의하여 크리스탈 바이올렛 작동 용액 1밀리리터로 각각 라벨을 붙입니다.
인큐베이션의 끝에서, 용액을 버리고 흡수성 용지 시트에 우물을 건조한 다음, 시작 용액의 총 바이러스 함량을 세 번 정량화하기 위해 가장 높은 희석에서 플라크 수를 세어한다. 이러한 입체 형광 영상 분석에서 관찰된 바와 같이, BX795의 항바이러스 효능은 바이러스 확산을 제어하는 TFT와 유사하며, 차량으로 치료된 각막은 6일 후 바이러스 접종까지 중앙 감염 영역에서 주변으로 바이러스의 확산을 입증한다. 유사하게, 감염 후 2일과 4일에 취한 안구 면봉은 양성 대조군 및 BX795 처리된 견본에 있는 바이러스의 완전한 억제를 나타내며, 감염성 바이러스 티터의 급격한 증가는 음성 대조료에서 관찰된다.
전체 돼지 눈에서 돼지 각막의 분리가 가장 중요한 단계입니다. 2.3에서 2.6 단계는이 과정에서 가장 중요합니다. 우리의 모형은 돼지 각막에 있는 바이러스의 수지상 퍼짐을 이해하기 위하여 이용될 수 있습니다.
이 방법은 세균성 및 곰팡이 감염으로확장될 수 있습니다. 이 방법은 인간 모형 외부 각막에 있는 바이러스의 수지상 퍼짐을 시각화하는 것을 도왔습니다. 이 모델은 동물 및 인체 실험으로 이동 하기 전에 약물의 효능을 테스트에 도움이 됩니다.
