Comprender la eficacia de los medicamentos en modelos animales es costoso y requiere mucha mano de obra. Nuestro protocolo que utiliza un modelo de explante de tejido ex vivo es significativamente menor tanto en términos de costo como de personal científico requerido para realizar el estudio. La principal ventaja de esta técnica es el uso de ojos porcinos, que tienen una anatomía y fisiología muy similares a los ojos humanos en comparación con algunos otros modelos de animales pequeños.
Cuando probamos medicamentos in vitro, pueden mostrar una eficacia que podría estar ausente en modelos animales o humanos. Los sistemas de tejidos ex vivo son la mejor manera de entender si nuestros sistemas in vitro pueden o no traducirse en ensayos en animales y humanos. El sistema de córnea porcina, aunque menos laboriosa, requiere habilidades entrenables para aislar, mantener, infectar y tratar con los medicamentos, especialmente el proceso de aislamiento de la córnea de todo el ojo porcino es difícil de expresar con palabras, pero requiere demostración visual.
Al recibir los ojos porcinos de un proveedor adecuado, almacene los pañuelos en hielo hasta su procesamiento y póngase el equipo de protección personal adecuado. Desinfecte el área de trabajo con etanol al 70% y asegure una cubierta de banco en el espacio de trabajo. Cuando el área de trabajo esté lista, coloque los ojos sobre una gasa de 50 milímetros y use la gasa para agarrar la sección posterior con una mano.
Usando una aguja de calibre 30, haga cuidadosamente una sola punción en aproximadamente el centro de la superficie epitelial del ojo, teniendo cuidado de no dañar el estroma, y use una cuchilla esterilizada afilada para hacer una pequeña incisión en la esclerótica a una distancia de un milímetro de la córnea. Usando una acción giratoria rápida y suave de la mano y cuidando que el humor vítreo no se filtre, corte el borde de la córnea y sostenga la córnea en el borde de la córnea-esclerótica con una pinza plana, use la cuchilla para cortar las membranas de anclaje restantes. A medida que se aísle cada córnea, coloque los tejidos boca arriba en los pozos individuales de una placa de 12 pozos que contenga dos mililitros de medio de córnea por pozo y agregue cinco microlitros de una unidad de cinco veces 10 a la quinta unidad formadora de placa de 17 solución de virus GFP al sitio desbridado en cada superficie corneal.
Cuando se hayan recolectado todas las córneas, coloque la placa a 37 grados Celsius, una incubadora de dióxido de carbono al 5% durante 72 horas y rocíe los ojos adicionales no utilizados en el experimento con lejía al 10% para su eliminación segura en bolsas de riesgo biológico. Todos los días antes de la adición de medicamentos, coloque la placa de córneas bajo un microscopio estereoscópico y seleccione el filtro GFP y un tiempo de exposición de 500 microsegundos. Capture las imágenes con el aumento más bajo antes de obtener imágenes de las córneas a una serie de aumentos crecientes hasta que toda la propagación viral y la formación de dendritas se puedan visualizar claramente.
Cuando se hayan fotografiado todas las córneas, devuelva la placa a la incubadora de cultivo de tejidos. El día antes de la infección, lave un cultivo de células vero confluentes dos veces con 10 mililitros de PBS por lavado, y trate las células con un mililitro de tripsina al 0,05% por pozo durante cinco a 10 minutos a 37 grados centígrados. Cuando las células se hayan desprendido, use nueve mililitros de medio entero para asegurarse de que las células se desalojen completamente de la superficie del matraz y transfiera la suspensión celular resultante a un tubo centrífugo de 15 mililitros.
Agregue 300 microlitros de células a cada pozo de una nueva placa de seis pozos, seguido de la adición de dos mililitros de medio a cada pozo, luego coloque la placa en la incubadora de cultivo celular durante la noche. A la mañana siguiente, para recoger el virus de cada córnea para su cuantificación, remoje las puntas de hisopo de algodón estéril en 500 microlitros de medio sin suero por hisopo en múltiples tubos de microcentrífuga en un gabinete de bioseguridad durante al menos cinco minutos. Al final de la incubación, coloque cuidadosamente los cultivos de córnea porcina infectada en el gabinete.
Usando los hisopos húmedos de algodón, haga tres revoluciones en el sentido de las agujas del reloj y tres revoluciones en sentido contrario a las agujas del reloj a cinco milímetros del centro de cada córnea porcina infectada sin aplicar una presión excesiva. Al final de la serie de revoluciones, gire cada hisopo en su tubo de microcentrífuga lleno de medio sin suero en el sentido de las agujas del reloj y en el sentido contrario a las agujas del reloj cinco veces antes de cortar los hisopos para que las puntas quepan dentro de cada tubo con la tapa cerrada. Cuando todas las córneas han sido hisopadas, vórtice los tubos a alta velocidad durante un minuto.
Para cuantificar la cantidad de virus recogido de cada córnea, prepare una dilución log10 de una sola vez del virus en medio libre de suero en tubos de microcentrífuga hasta que se alcance una dilución de una vez 10 a los ocho negativos. Después de aspirar el medio de crecimiento de cada pozo de células, transfiera un mililitro de cada dilución del virus a partir de una vez 10 a las tres negativas a las monocapas de células chapadas y coloque las células infectadas en la incubadora de cultivo celular durante dos horas. Al final de la incubación, lave suavemente cada pozo dos veces con PBS antes de agregar dos mililitros de medio cargado de metilcelulosa a cada pozo durante una incubación de 72 horas o hasta que se pueda observar la formación de placas.
Tras la observación de la placa, agregue lentamente un mililitro de metanol a la esquina de cada pozo durante una incubación de 15 minutos a temperatura ambiente. Al final de la incubación, aspire lentamente el contenido de cada pozo sin perturbar la monocapa celular. A continuación, etiquete cada pozo con un mililitro de solución de trabajo violeta de cristal, teniendo cuidado de que todas las células estén cubiertas para una incubación de 30 minutos protegida de la luz.
Al final de la incubación, deseche la solución y seque los pomos en una hoja de papel absorbente, luego cuente el número de placas en el pozo de dilución más alto para cuantificar el contenido total de virus en la solución inicial tres veces. Como se observa en este análisis de imágenes de fluorescencia estereoscópica, la eficacia antiviral de BX795 es similar a la de TFT en el control de la propagación viral, mientras que las córneas tratadas con vehículo solo demuestran la propagación del virus desde la zona de infección central a la periferia a los seis días posteriores a la inoculación viral inicial. Del mismo modo, los hisopos oculares tomados en los días dos y cuatro posteriores a la infección exhiben una inhibición completa del virus en las muestras de control positivas y tratadas con BX795, mientras que se observa un fuerte aumento en el título del virus infeccioso en las muestras de control negativas.
El aislamiento de la córnea porcina de todo el ojo porcino es el paso más importante. Los pasos 2.3 a 2.6 son los más cruciales en este proceso. Nuestro modelo se puede utilizar para comprender la propagación dendrítica del virus en córneas porcinas.
Este método también se puede extender hacia las infecciones bacterianas y fúngicas. Este método ha ayudado a visualizar la propagación dendrítica del virus en córneas fuera de un modelo humano. Este modelo es útil para probar la eficacia de los medicamentos antes de avanzar hacia los ensayos en animales y humanos.
