İlaçların hayvan modellerindeki etkinliğini anlamak maliyet ve emek yoğundur. Eks vivo doku eksplant modeli kullanan protokolümüz hem maliyet hem de çalışmayı yürütmek için gerekli bilimsel personel açısından önemli ölçüde daha düşüktür. Bu tekniğin ana avantajı, diğer bazı küçük hayvan modellerinin aksine insan gözlerine çok benzeyen anatomi ve fizyolojiye sahip porcine gözlerinin kullanılmasıdır.
İlaçları in vitro olarak test ettiğimizde, hayvan veya insan modellerinde bulunmayan etkinliği gösterebilirler. Ex vivo doku sistemleri, in vitro sistemlerimizin hayvan ve insan denemelerine çevrilip çevrilmediğini anlamanın en iyi yoludur. Porcine kornea sistemi, daha az emek yoğun olmasına rağmen, ilaçları izole etmek, sürdürmek, enfekte etmek ve tedavi etmek için eğitilebilir beceriler gerektirir, özellikle korneanın tüm porcine gözünden izolasyon süreci kelimelerle ifade etmek zordur, ancak görsel gösteri gerektirir.
Uygun bir satıcıdan porcine gözleri aldıktan sonra, dokuları işleme kadar buzda saklayın ve uygun kişisel koruma ekipmanını takın. Çalışma alanını %70 etanol ile dezenfekte edin ve çalışma alanına bir tezgah kapağı sabitleyin. Çalışma alanı hazır olduğunda, gözleri 50 milimetrelik bir gazlı bez parçasına yerleştirin ve arka bölümü tek elle kavramak için gazlı bezi kullanın.
30 kalibrelik bir iğne kullanarak, gözün epitel yüzeyinin yaklaşık merkezinde dikkatlice tek bir delinme yapın, stromaya zarar vermemeye dikkat edin ve korneadan bir milimetre mesafede sklera üzerinde küçük bir kesi yapmak için keskin bir sterilize bıçak kullanın. Elin hızlı ve pürüzsüz bir şekilde dönen bir eylemini kullanarak ve vitreus mizahının sızmadığına dikkat ederek, korneanın kenarını kesin ve kornea-sklera kenarında düz bir cımbızla tutun, kalan bağlama zarlarını kesmek için bıçağı kullanın. Her kornea izole edildikçe, dokuları kuyu başına iki mililitre kornea ortamı içeren 12 kuyulu bir plakanın ayrı kuyularına yerleştirin ve her kornea yüzeyindeki enkaz alanına 17 GFP virüs çözeltisinin beşinci plak oluşturan ünitesine beş kez 10'un beş mikrolitresini ekleyin.
Tüm kornealar toplandığında, plakayı 37 santigrat dereceye, 72 saat boyunca% 5 karbondioksit inkübatörüne yerleştirin ve deneyde kullanılmayan ek gözleri biyolojik tehlike torbalarında güvenli bir şekilde bertaraf etmeleri için% 10 çamaşır suyu ile püskürtün. İlaçların eklenmesinden önce her gün kornea plakasını stereo mikroskop altına yerleştirin ve GFP filtresini ve 500 mikrosaniyelik maruz kalma süresini seçin. Tüm viral yayılma ve dendrit oluşumu net bir şekilde görselleştirilebilene kadar korneaları bir dizi artan büyütmede görüntülemeden önce görüntüleri en düşük büyütmede yakalayın.
Tüm kornealar görüntülendiğinde, plakayı doku kültürü inkübatörüne geri verin. Enfeksiyondan bir gün önce, bir izdiah vero hücre kültürünü yıkama başına 10 mililitre PBS ile iki kez yıkayın ve hücreleri 37 santigrat derecede beş ila 10 dakika boyunca kuyu başına% 0.05 trypsin mililitresi ile tedavi edin. Hücreler ayrıldığında, hücrelerin şişe yüzeyinden tamamen yerinden çıkmasını sağlamak ve elde edilen hücre süspansiyonu 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarmak için dokuz mililitrelik tüm ortamı kullanın.
Yeni altı kuyu plakasının her kuyusuna 300 mikrolitre hücre ekleyin, ardından her kuyuya iki mililitre orta ekleyin, ardından plakayı bir gecede hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin. Ertesi sabah, virüsü nicelleştirme için her korneadan toplamak için, steril pamuklu çubuk uçlarını, bir biyogüvenlik kabininde birden fazla mikrosantrifüj tüpünde svap başına 500 mikrolitre serumsuz ortamda en az beş dakika bekletin. Kuluçkanın sonunda, enfekte porcine kornea kültürlerini dikkatlice kabine yerleştirin.
Islak pamuklu çubukları kullanarak, aşırı basınç uygulamadan her enfekte porcine korneanın merkezinden saat yönünde üç devir ve saat yönünün tersine üç devir yapın. Devir serisinin sonunda, serumsuz orta dolgulu mikrosantrifüj tüpündeki her bir çubuğu saat yönünde ve saat yönünün tersine beş kez döndürün, böylece uçlar kapak kapalı olan her tüpün içine sığar. Tüm kornealar temizlendiğinde, tüpleri bir dakika boyunca yüksek hızda girdapla.
Her korneadan toplanan virüs miktarını ölçmek için, mikrosantrifüj tüplerinde serumsuz ortamda virüsün bir kat seyreltilmesini, negatif sekize bir kez 10'luk bir seyreltmeye ulaşılana kadar hazırlayın. Büyüme ortamını her hücre kuyusundan epire ettikten sonra, bir kere 10'dan başlayan her virüs seyreltmesinin bir mililitresini plakalı hücre monolayerlerine negatif üçe aktarın ve enfekte hücreleri iki saat boyunca hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin. Kuluçkanın sonunda, 72 saatlik bir inkübasyon için veya plak oluşumu gözleninceye kadar her kuyuya iki mililitre metilselüloz yüklü ortam eklemeden önce pbs ile her kuyuyu iki kez hafifçe yıkayın.
Plak gözlemi üzerine, oda sıcaklığında 15 dakikalık bir inkübasyon için her kuyunun köşesine yavaşça bir mililitre metanol ekleyin. Kuluçkanın sonunda, hücre monolayerini rahatsız etmeden her kuyudaki içeriği yavaşça aspire edin. Daha sonra, her bir kuyuyu bir mililitre kristal mor çalışma çözeltisi ile etiketlenin, tüm hücrelerin ışıktan korunan 30 dakikalık bir inkübasyon için kaplandığına dikkat edin.
Kuluçkanın sonunda, çözeltiyi atın ve kuyuları emici bir kağıt tabakası üzerinde kurutun, ardından başlangıç çözeltislerindeki toplam virüs içeriğini üç kez ölçmek için plak sayısını en yüksek seyreltme kuyusunda sayın. Bu stereoskopik floresan görüntüleme analizinde gözlemlendiği gibi, BX795'in antiviral etkinliği viral yayılmayı kontrol etmede TFT'ninkine benzerken, araçla tedavi edilen kornealar virüsün merkezi enfeksiyon bölgesinden çevreye yayılmasını sadece ilk viral aşılamadan altı gün sonra göstermektedir. Benzer şekilde, enfeksiyon sonrası ikinci ve dördüncü günlerde alınan oküler sürüntüler pozitif kontrol ve BX795 ile tedavi edilen örneklerde tam bir virüs inhibisyonu sergilerken, negatif kontrol örneklerinde enfeksiyöz virüs titresinde keskin bir artış gözlenmektedir.
Porcine korneasının tüm porcine gözünden izolesi en önemli adımdır. 2.3 ile 2.6 arasında adımlar bu süreçte en önemli olanıdır. Modelimiz, virüsün porcine kornealarındaki dendritik yayılımını anlamak için kullanılabilir.
Bu yöntem bakteriyel ve mantar enfeksiyonlarına da doğru genişletilebilir. Bu yöntem, virüsün kornealarda bir insan modeli dışında dendritik yayılmasını görselleştirmeye yardımcı olmuştur. Bu model, hayvan ve insan denemelerine geçmeden önce ilaçların etkinliğini test etmede yardımcıdır.
