用于表征用于超声触发药物释放的荧光标记微气泡的多时间尺度显微镜方法

该协议可用于表征荧光标记微气泡的反应，这些微气泡设计用于超声触发的药物递送应用，包括激活机制和生物效应。关键在于成像技术的结合，这使我们能够在不同的空间尺度和不同的时间尺度上解开超声波触发的气泡药物递送的多尺度问题。对于通过明场显微镜进行的单气泡成像，放置一个19号通气针，并使用配备19号针头的一毫升注射器将少量微气泡悬浮液从玻璃瓶中除去到小管中，以便在下一步中更容易移液。

使用移液器，将微气泡溶液稀释在过滤的磷酸盐缓冲盐水中。使用10毫升注射器将样品注入样品架的一个出口，直到支架充满而不会产生气泡，必要时注入更多样品。关闭样品架的两个阀门，并将样品架垂直于显微镜的光轴放置。

在样品分析之前，在任意波形发生器上设置所需的超声驱动频率和声压，并从样品架一角的视场开始，使用XYZ载物台移动支架以定位显微镜视野中的单个微泡，然后将连接到水浴的光纤连接到频闪灯并开始记录。根据超声设置，根据需要多次重复成像，将样品架移动到包含未声速微气泡的视野中，以进行每次分析。对于微气泡的荧光显微成像，在如图所示稀释磷酸盐缓冲盐水中的微气泡溶液后，在任意波形发生器上设置所需的超声驱动频率和声压，并在脉冲延迟发生器上设置激光的触发延迟，用于从微气泡中激发纳米颗粒的荧光，然后使用XYZ载物台移动样品架以定位单个微气泡并将它们带入焦点 目标，然后触发记录。

根据需要通过改变超声设置并将样品架移动到新的视野来重复成像，如图所示。对于活体显微镜成像，首先将加热的动物支架放置在波导和物镜之间的XY定位台上，并向波导中加入耦合凝胶。将尾静脉导管插入麻醉的含肿瘤小鼠的尾静脉中，并将装有窗室的小鼠放入加热的支架中。

在盖玻片上加入水滴。为了可视化肿瘤组织脉管系统，静脉注射30微升每毫升4毫克荧光标记的2兆道尔顿葡聚糖到尾静脉导管中，并使用XY平移阶段移动小鼠，直到可以找到具有合适血管的视野。根据实验参数调整帧速率，视野和记录长度，并记录容器的基线图像。

获取基线图像后，在任意波形发生器上设置超声驱动频率、脉冲长度和声压幅度，并静脉注射50微升微气泡样品到尾静脉中。然后如图所示对脉管系统进行成像。通过共聚焦荧光显微镜对微气泡进行分析，揭示了微气泡壳的不均匀颗粒分布。

微气泡的整体结构可以通过扫描电子显微镜进一步可视化。通过明场显微镜分析不均匀微气泡的径向动力学和现象学行为，可以评估微气泡半径随时间变化的相对变化。在这里，显示了典型成功递送荧光标记纳米颗粒的图像序列。

嵌入微气泡壳中的纳米颗粒可以观察到激光到达气泡时发出荧光。然而，正如在这种不成功的递送中观察到的那样，荧光纳米颗粒照射在微气泡的外壳上，其在超声暴露期间保持完整。活体多光子成像可用于确定超声暴露期间纳米颗粒的空间和时间外渗，这有利于理解和优化超声介导的纳米颗粒递送机制。

通过在所有长度和时间尺度上对光学和声学通路进行完美排列，可以全面了解超声触发的药物递送。我们的多尺度实验提供的答案现在将被转化为临床实践。这些结果将为包括癌症治疗在内的一系列治疗应用提供有价值的见解。