Этот протокол может быть использован для характеристики реакции флуоресцентно меченых микропузырьков, которые предназначены для ультразвуковых приложений доставки лекарств, которые включают механизмы активации и биоэффекты. Ключ заключается в сочетании методов визуализации, которые позволяют нам разгадать многомасштабную проблему ультразвуковой доставки лекарств с пузырьками, как в разных пространственных масштабах, так и в разных временных масштабах. Для однопузырьковой визуализации с помощью микроскопии Brightfield поместите вентиляционную иглу 19 калибра и используйте один миллилитровый шприц, оснащенный иглой 19 калибра, чтобы удалить небольшое количество микропузырчатой суспензии из стеклянного флакона в небольшую трубку для облегчения пипетки на следующем этапе.
Используя пипетку, разбавьте микропузырьковый раствор в фильтрованном фосфатном буферном физиологическом растворе. Используйте 10-миллилитровый шприц для введения образца в одно выходное отверстие держателя образца до тех пор, пока держатель не заполнится без создания пузырьков воздуха, впрыскивая больше образца, если это необходимо. Закройте оба клапана держателя образца и поместите держатель образца перпендикулярно оптической оси микроскопа.
Перед анализом образца установите желаемую частоту ультразвукового привода и акустическое давление на генератор сигналов произвольной формы и, начиная с поля зрения в одном углу держателя образца, используйте ступень XYZ для перемещения держателя, чтобы найти отдельные микропузырьки в поле зрения микроскопа, затем присоедините оптическое волокно, подключенное к водяной бане, к стробоскопическому свету и начните запись. Повторите визуализацию столько раз, сколько необходимо для каждой настройки ультразвука, перемещая держатель образца по крайней мере на два миллиметра в поле зрения, содержащее микропузырьки без звука для каждого анализа. Для флуоресцентной микроскопической визуализации микропузырьков, после разбавления микропузырька в фосфатно-буферном физиологическом растворе, как показано, установите желаемую частоту ультразвукового привода и акустическое давление на генератор сигналов произвольной формы и установите триггерную задержку для лазера на генераторе задержки импульсов для флуоресцентного возбуждения наночастиц из микропузырьков, затем используйте стадию XYZ для перемещения держателя образца для обнаружения одиночных микропузырьков и приведения их в фокус цель, затем запустите запись.
Повторите визуализацию по своему усмотрению, изменив настройки ультразвука и переместив держатель образца в новое поле зрения, как показано на рисунке. Для визуализации с помощью прижизненной микроскопии сначала поместите нагретый держатель животного на ступень позиционирования XY между волноводом и объективом и добавьте соединительный гель к волноводу. Вставьте катетер хвостовой вены в хвостовую вену анестезируемой опухоленосной мыши и поместите мышь, оснащенную оконной камерой, в нагретый держатель.
Добавьте каплю воды в крышку. Чтобы визуализировать сосудистую ткань опухоли, внутривенно вводят 30 микролитров по четыре миллиграмма на миллилитр флуоресцентно меченого 2 мегадальтонного декстрана в катетер хвостовой вены и используют стадию трансляции XY для перемещения мыши до тех пор, пока не будет найдено поле зрения с подходящими кровеносными сосудами. Отрегулируйте частоту кадров, поле зрения и длину записи в соответствии с параметрами эксперимента и запишите базовые изображения сосудов.
После получения исходных изображений установите частоту ультразвукового привода, длину импульса и амплитуду акустического давления на генераторе сигналов произвольной формы и внутривенно введите 50 микролитров микропузырькового образца в хвостовую вену. Затем изобразите сосудистую систему, как показано. Анализ микропузырьков конфокальной флуоресцентной микроскопией выявляет неравномерное распределение частиц микропузырьковой оболочки.
Общая структура микропузырьков может быть дополнительно визуализирована с помощью сканирующей электронной микроскопии. Анализ радиальной динамики и феноменологического поведения инсонифицированного микропузырька методом микроскопии Брайтфилда позволяет оценить относительное изменение радиуса микропузырька с течением времени. Здесь показана последовательность изображений типичной успешной доставки флуоресцентно меченых наночастиц.
Можно наблюдать, как наночастицы, встроенные в микропузырьковую оболочку, флуоресцируют, когда лазерный свет достигает пузыря. Однако, как наблюдалось в этой неудачной доставке, флуоресцентные наночастицы светятся на оболочке микропузырька, которая остается неповрежденной во время ультразвукового воздействия. Прижизненная многофотонная визуализация может быть использована для определения пространственной и временной экстравазации наночастиц во время ультразвукового воздействия, что может быть полезно для понимания и оптимизации механизмов, лежащих в основе доставки наночастиц, опосредованных ультразвуком.
Благодаря идеальному выравниванию оптических и акустических путей на всех протяженностях и во всех временных масштабах обеспечивается всестороннее понимание доставки лекарств, вызванных ультразвуком. Ответы, полученные в результате наших многомасштабных экспериментов, теперь будут переведены в клиническую практику. Результаты предоставят ценную информацию для целого ряда терапевтических применений, включая терапию рака.
