使用沉降机进行冷冻电镜和单颗粒分析

Scipion提供了以综合方式创建整个处理工作流程的工具，用于冷冻电镜中的单个颗粒分析，以实现生物标本的高分辨率重建。该框架使得使用多个图像处理包创建处理工作流成为可能，有利于互操作性，可追溯性，可重复性以及通过不同方法传达的信息的组合，以生成更准确的输出。Scipion正在不断发展，包括新的方法和包装。

此外，它已扩展到冷冻电子断层扫描和原子建模，还允许创建处理这些数据的工作流程。要在 Scipion 中创建项目，请单击"创建项目"以创建项目。要导入显微镜影片，请选择"导入影片"。

将出现一个新窗口。在此窗口中，输入数据路径，并将显微镜电压设置为 300 千伏，球面像差设置为 2 毫米，振幅对比度设置为 0.1，放大倍率设置为 50， 000，采样率模式设置为"从"图像，像素大小设置为 1.34 埃。设置完所有参数后，单击"执行"。

方法完成后，打开"摘要"选项卡，单击"分析结果"。将出现一个新窗口，其中包含该方法生成的输出列表。要运行光流方法进行短片对齐，请打开 xmipp3 光学对齐方法，然后选择导入的短片作为输入短片，并将"帧"设置为 ALIGN 范围从 2 到 13。

在"其他参数"下，将"使用以前的影片对齐方式对帧求和"选项设置为"否"。将所有其他选项的设置保留为其默认值并执行程序。单击分析结果以检查获得的显微照片和估计位移的轨迹。对于每个显微照片，可以检查功率光谱密度，在笛卡尔和极坐标中对齐电影所获得的轨迹，以及所获得的显微照片的文件名。

请注意，与影片的单帧相比，标本的颗粒在显微照片中更明显。对于颗粒拾取，请打开 xmipp3 手动拾取方法，然后选择先前获得的显微照片作为输入显微照片。单击"执行"。

将出现一个新的交互式窗口。在此窗口中，将像素大小更改为 150。选定的显微照片将显示在更大的窗口中。

选择一个区域内的所有可见粒子。手动选取所有粒子后，单击"激活训练"开始学习。显微照片的其余区域将被自动拾取。

检查拾取的粒子。要包含其他粒子，请单击感兴趣的粒子。要删除任何不正确的粒子，请按住 Shift 并根据需要单击粒子。

当所有粒子都被自动拾取时，一次选择一个接下来的四个显微照片以创建一个具有代表性的训练集。每个选定的显微照片中的颗粒将被自动拾取，并根据需要检查每个显微照片以包含或移除颗粒。获取训练集后，单击坐标以保存所有选取的粒子的坐标。

获取训练集后，打开 xmipp3 自动拾取以指示 Xmipp 粒子拾取运行中的先前手动拾取，并将"显微照片"设置为"与监督时相同"。单击"执行"以生成一组大约 100， 000 个坐标。要应用共识方法，请打开 sphire cryolo 拾取，并将预处理的显微照片作为拣选模型中的输入显微照片设置为默认值。

将置信度阈值设置为 0.3，将"框大小"设置为 150，然后单击"执行"。该方法还应生成大约 100， 000 个坐标。接下来，打开 xmipp3 深度共识选取并将输入坐标设置为包括 sphire cryolo 和 xmipp3 自动拾取的输出、选择要预训练的模型类型以及将"使用预训练模型直接跳过训练并得分"设置为"是"，然后单击"执行"。

在执行结束时，单击"分析结果"。在新窗口中，单击眼睛图标。将打开第二个新窗口，其中包含所有粒子的列表。

列中的 Z 得分值将深入了解每个粒子的质量，因为低值表示质量较差。要按从最高 Z 得分到最低 Z 得分对粒子进行排序，请单击"深度学习 Xmipp Z 分数"，然后选择 Z 分数高于 0.75 的粒子。然后单击坐标以创建具有大约 50， 000 个坐标的新子集。

要在本地计算分辨率，请打开 xmipp3 本地 MonoRes 并将输入音量设置为上一个细化步骤的输出，将"是否要使用一半体积"设置为"是"，并将"分辨率范围"设置为 1 到 10 埃。设置参数后，单击"执行"。计算出分辨率后，单击分析结果，然后选择显示分辨率直方图和显示彩色切片。

将显示体积不同部分的分辨率。结构中心部分的大多数体素应该代表三埃周围的分辨率，而最差的分辨率将在结构的外部区域观察到。还将显示每个体素的分辨率直方图，峰值在三埃左右或以下。

要应用锐化，请打开 xmipp3 局部模糊锐化，选择上一个细化步骤的输出作为输入映射，然后将分辨率映射设置为获取 MonoRes 映射。执行命令后，双击"摘要"选项卡中作为输出生成的卷集。可以检查每次迭代中生成的卷。

还建议使用其他工具（如 UCSF Chimera）打开体积，以更好地观察 3D 中体积的特征。在该图中，可以观察到三埃的傅里叶壳层相关性，非常接近奈奎斯特极限。如图所示，重建的 3D 体积切片表现出高水平的细节和明确定义的结构。

经过局部分析，大多数中心体素的分辨率低于三埃。然而，局部分辨率切片的外部区域表现出较低的分辨率，这与在这些区域内观察到的模糊一致。经过后期处理后，可以观察到3D地图体积的较高频率，从而揭示更多细节并改善表示效果。

当达到的分辨率足够高时，甚至可以观察到结构的某些生化部分。如果获得的结构具有低分辨率，并且无法演变成更好的结构，则可以观察到具有低傅里叶壳相关，分辨率曲线和局部估计直方图的模糊体积。采摘后，可以检查2D分类以评估颗粒质量。

例如，在此分类中，粒子是嘈杂的、未居中的或耦合的，这表明拾取不正确。可以在初始体积估计期间执行另一个检查点。在此示例中，使用不正确的方法设置创建了错误的估计值。

一旦产生了具有足够分辨率的3D地图，下一步就是为地图提出原子模型。这可以在Scipion中使用建模插件完成。该技术可用于成功重建生物大分子，以评估其分子相互作用和生物集合功能，作为药物设计的基础。