单颗粒冷冻电子显微镜是以接近原子分辨率结构化测定大分子的方法。多个软件包可用于图像处理和结构计算，但由于计算过程中应用的算法不同，3D地图上的结果通常在质量和分辨率上有所不同。因此，使用不同程序的组合通常有利于实现最佳结果。
该协议指导用户在三个不同的冷冻电镜处理平台上导航工作流程：CryoSPARC、RELION和Scipion。我们将演示如何使用该管道获得腺相关病毒的高分辨率结构，该病毒是基因治疗的广泛使用载体。在 Web 浏览器中打开 CryoSPARC v3 并为项目创建工作区后，导航到新工作区并在右侧面板上打开作业生成器。
单击导入电影并提供电影路径并获得参考文件路径。然后设置采集参数。接下来，单击队列，选择用于运行作业的通道和工作区，然后单击“创建”。
打开补丁运动校正和导入影片作业卡。然后将imported_movies输出拖动到新作业上的电影占位符中，并对作业进行排队。要执行对比度传递函数或 CTF 估计，请打开贴片 CTF 估计。
输入生成的显微照片并将作业排入队列。要检查平均和CTF校正的显微照片并选择子集进行进一步处理，请打开策划曝光，输入从上一步获得的曝光并将作业排队。作业进入等待模式后，单击作业卡上的交互式选项卡。
调整参数阈值，接受或拒绝单个显微照片以进行进一步处理。在处理当前数据时，将散光的上限阈值设置为400埃，CTF拟合分辨率设置为5埃，相对冰厚设置为2。然后单击“完成”以选择用于下游处理的显微照片。
对于基于手动的拣选，请打开手动拣选器。输入接受的公开并对作业进行排队。然后单击交互式选项卡，将框大小设置为300像素，然后单击多个显微照片上的几百个粒子，避免重叠粒子。
完成选择后，单击完成选择提取物颗粒。接下来，要生成用于自动粒子拾取的模板，请单击 2D 分类并输入生成的粒子拾取。然后将 2D 类的数量更改为 10 并使作业排队。
接下来，打开选择 2D 类并输入在上一步中获得的粒子和类平均值。然后单击交互式选项卡，选择具有良好信噪比的代表性2D类，然后单击完成。对于基于模板的粒子拾取，打开模板选取器并输入选定的 2D 类和显微照片。
然后将颗粒直径设置为 220 埃并对作业进行排队。最后，打开显微照片的提取，并输入从检查颗粒拾取中获得的显微照片和颗粒。然后将提取的框大小设置为 300 像素，并对作业进行排队。
对于 2D 分类，请单击 2D 分类并输入提取的粒子。然后将 2D 类的数量设置为 50 并将作业排入队列。接下来，打开选择 2D 类并输入获得的粒子和类平均值。
单击交互式选项卡。根据分辨率和类中的粒子数选择 2D 类，然后单击“完成”。要生成初始 3D 体积，请打开从头开始重建并输入来自最终 2D 分类的粒子。
然后将对称性调整为二十面体并对作业进行排队。接下来，开放均质细化，输入上一步的体积和最终2D分类中的颗粒。然后更改对称性并对作业进行排队。
作业完成后，检查傅里叶壳相关或 FSC 曲线并下载体积以在 UCSF Chimera 中进行检查。在 CryoSPARC v3 中，打开从最终 2D 分类中选择 2D 类作业的作业卡。然后在详细信息选项卡上，单击导出作业。
使用 PyEM 转换particles_exported。cs 文件通过执行指示的命令加星格式。单击粒子提取后，在“I/O”选项卡中，输入 CTF 校正后的显微照片和坐标。
然后单击“提取”选项卡，将粒子框大小更改为300像素并运行作业。对于 3D 优化，请使用 CryoSPARC v3 中生成的地图作为 RELION-3 中的初始模型。选择导入方法，并在 I/O 选项卡中设置指示的参数。
然后在“其他”选项卡上，选择 CryoSPARC v3 映射作为输入文件，将节点类型更改为 3D 引用并运行作业。接下来，选择 3D 自动优化，然后在 I/O 选项卡上，将输入图像设置为粒子。上一个选择作业中的星号文件。
使用 CryoSPARC v3 重建作为参考图，单击参考选项卡，将初始低通滤波器更改为 50 埃，将对称性更改为二十面体。然后在优化选项卡上，将掩模直径更改为 280 埃并运行作业。对于后处理，请单击“后处理”。
在 I/O 选项卡上，输入创建的半图和掩码，并将校准的像素大小设置为 1.045 埃。然后在锐化选项卡上，要自动估计B因子，请输入yes。对于自动 B 拟合的最低分辨率，请输入 10。
为了使用您自己的B因子，输入no。最后，在筛选器选项卡上，将跳过 FSC 加权设置为 no 并运行作业。对于抛光培训，请打开贝叶斯抛光。
在“I/O”选项卡上，输入运动校正后的显微照片、粒子和后处理。以前获得的星号文件。单击训练选项卡并将训练最佳参数设置为 yes，用于测试的傅里叶像素的分数设置为 0.5，并将这多个粒子设置为 5， 000。
然后运行作业。训练作业完成后，单击贝叶斯抛光。然后在训练选项卡中，将训练最佳参数设置为 no。
选择抛光选项卡，然后在优化的参数文件中，指定opt_params_all_groups路径。上一步中的 txt 文件，然后单击“运行”。要估计高阶像差，请打开 CTF 细化。
在“I/O”选项卡上的“粒子”下，选择指向星形文件的路径，该文件包含来自最近改进的 3D 作业的抛光粒子。然后在后处理 STAR 文件下，设置最新后处理作业的输出路径。接下来，选择拟合选项卡并将估计各向异性放大倍率设置为 no。
执行 CTF 参数拟合到 no。估计光束高跷为是。还要估计三叶草到是。
并估计四阶畸变为是。然后运行作业。要进一步优化和验证 RELION-3 地图，请启动 Scipion 3 并创建一个新项目。
在左侧协议面板上，选择导入下拉列表，然后单击导入粒子。将参数导入从 RELION-3 更改为，将 star 文件更改为 postprocess.star。然后指定采集参数，如前所述，然后单击执行。
接下来，单击导入下拉列表，然后选择导入卷。在“导入自”下，提供 RELION-3 地图的路径，将像素大小采样率更改为每像素 1.045 埃并执行。要执行全局对齐，请从协议面板中选择优化下拉菜单，然后单击xmipp3-highres。
将前面步骤中导入的粒子和体积分别输入为全尺寸图像和初始体积，并将对称组设置为二十面体。然后在“角度分配”下的图像对齐选项卡上，选择“全局”，将最大目标分辨率设置为三埃并运行作业。要执行本地对齐，请选择 xmipp3-highres 全局，将“继续”从上一次运行更改为“是”，然后选择上一个作业。
然后在角度分配选项卡上，将图像对齐更改为局部，并将最大目标分辨率设置为 2.1 埃。完成后，在 xmipp3-highres 结果窗口中，单击显示分辨率图以查看 FSC 在细化后如何变化，然后单击具有角度变化的绘图直方图以查看欧拉角分配是否已更改。检查UCSF Chimera中的体积。
放大并查找高分辨率功能。选择具有良好CTF拟合和低散光的显微照片进行进一步处理，而丢弃具有高散光和没收的显微照片。选择包含明确定义类的2D类平均值，并拒绝具有低分辨率，噪声和部分粒子的2D类平均值。
此处显示了装有腺相关病毒原子坐标的冷冻电子显微镜图谱的区域。明确定义的EM密度允许拟合单个氨基酸，水分子和镁离子的侧链。使用 CryoSPARC v3、RELION-3 和 Scipion 计算的 FSC 曲线表明，整个工作流程的分辨率不断提高，通过结构和分辨率直方图估算的四个不同切片的分辨率表明，在整个工作流程中，地图之间的局部分辨率逐渐提高。
结合 CryoSPARC、RELION-3、Scipion 和 Phoenix 的冷冻电镜处理算法，使整个处理管道中腺相关病毒结构的分辨率从 2.9 埃增加到 2.3 埃。重要的是要记住，每个步骤中指定的参数都取决于样品和显微镜。此外，达到高分辨率的能力在很大程度上取决于样品和原始数据的质量。
在本视频中，我们介绍了用于跨各种软件平台处理冷冻电镜数据的强大 SP 工作流程。通过使用这种方法，可以为多个程序实现算法，以优化和验证冷冻结构。此工作流可应用于各种大分子组件的结构计算。
