使用Leginon进行载物台倾斜的单颗粒冷冻电镜数据收集

倾斜样品台提供了一种简单且可推广的方法，可以在单颗粒冷冻电镜数据收集期间增加颗粒的方向分布。由于样品台倾斜而获得的颗粒的均匀分布可以提高整体地图质量和可解释性。首先对准显微镜，以确保标本的平行照明并最大限度地减少彗差。

要确定适合数据收集的方块，请记录一个没有载物台倾斜或带载物台倾斜的网格图集，该图集提供了整体网格质量的概述，并初步指示了适合数据收集的区域。在正方形采集节点中使用的放大倍率下手动检查正方形。寻找箔片完好无损、看起来不脱水且具有理想冰厚度的正方形，并将标本载物台移动到感兴趣的正方形。

使用载物台倾斜约15度的α摆动器确定载物台位置的共心高度，并使用显微镜的键盘面板调整Z高度以使载物台达到共心高度。确保在 Alpha 摆动例程期间图像偏移最小。要找到更准确的 Z 高度，请在聚焦器节点中以方形采集节点中使用的放大倍率估计它。

调整聚焦器节点的设置，并在正方形初始排队期间启用或禁用精细 Z 焦点选项。然后按模拟。将样品载物台倾斜到所需的倾斜角度，以便在真正的真心高度收集数据，并在必要时将载物台重新居中。

在方形采集节点中按模拟，开始排队整个采集节点曝光的目标。接下来，选择一个Z焦点目标和具有适合高倍率曝光的孔的区域，并将目标提交到队列进行成像。将标本载物台恢复到未倾斜的状态，然后移动到下一个正方形。

重复这些步骤，直到排队的整个曝光次数足够多。所有方块排队后，转到整个目标节点，然后按提交排队目标。在节点设置中选择允许用户验证所选目标，然后手动检查高倍率曝光采集节点选择的目标，以测试当标本载物台倾斜时，自动EM孔查找器是否可以准确识别适合图像采集的区域。

用户对定位准确性感到满意后，取消选择允许用户验证所选目标选项以自动收集数据。此处显示了在方形放大倍率下收集的不同倾斜角度的网格的代表性图像，这些图像收集的齐心Z高度附近和远处。光束的中心由红色同心环的中心表示，绿色箭头表示感兴趣的正方形。

在感兴趣的正方形旁边有一个断开的格网要素以供参考。此处显示的是 0 度、30 度和 60 度倾斜角度下收集的代表性孔暴露和 2D 类平均值。尽管在不同的倾斜角度下蛋白质浓度保持不变，但较高的倾斜角度使成像区域在颗粒浓度方面显得更加拥挤。

受过度拥挤影响的 2D 类平均值显示在此红色框中。该方案的简单性使显微镜的任何标准用户都可以轻松调整倾斜的数据收集策略。