Scipionは、生物学的標本の高解像度の再構築を達成するために、cryo-EMで単一の粒子分析のための統合的な方法で全体の処理ワークフローを作成するためのツールを提供します。このフレームワークにより、複数の画像処理パッケージを使用して処理ワークフローを作成し、相互運用性、トレーサビリティ、再現性、および異なる方法で伝えられる情報の組み合わせを使用して、より正確な出力を生成することができます。新しい方法やパッケージを含め、シピオンは絶えず成長しています。
さらに、クライオ電子断層撮影や原子モデリングにも拡張され、これらのデータを処理するワークフローを作成することもできます。Scipion でプロジェクトを作成するには、[プロジェクトの作成] をクリックしてプロジェクトを作成します。顕微鏡ムービーを読み込むには、[ムービーをインポート] を選択します。
新しいウィンドウが表示されます。このウィンドウでは、データへのパスを入力し、顕微鏡電圧を300キロボルト、球面収差を2ミリメートル、振幅比を0.1、倍率を50,000、サンプリングレートモードをFrom画像に、ピクセルサイズを1.34オングストロームに設定します。すべてのパラメータが設定されたら、[実行]をクリックします。
メソッドが終了したら、[概要] タブを開き、[結果の分析] をクリックします。メソッドによって生成された出力の一覧が新しいウィンドウに表示されます。ムービーのアライメント用のオプティカル フローメソッドを実行するには、xmipp3 オプティカル アライメントメソッドを開き、インポートしたムービーを入力ムービーとして選択し、フレームを 2 ~ 13 の範囲に設定します。
[追加のパラメータ] で、[以前のムービーの配置を SUM フレームに使用する] オプションを [No.] に設定します。[結果を分析]をクリックして、取得した顕微鏡写真と推定シフトの軌道を確認します。すべての顕微鏡写真について、パワースペクトル密度、デカルト座標と極座標の両方でムービーを整列させるために得られた軌道、および取得した顕微鏡写真のファイル名を確認することができる。
標本の粒子は、ムービーの単一のフレームと比較して、顕微鏡写真ではるかに見えることに注意してください。パーティクルのピッキングの場合は、xmipp3 手動ピッキング方法を開き、入力顕微鏡写真として以前に取得した顕微鏡写真を選択します。[実行] をクリックします。
新しいインタラクティブウィンドウが表示されます。このウィンドウで、ピクセル サイズを 150 に変更します。選択した顕微鏡写真が大きなウィンドウに表示されます。
1 つの領域内の可視パーティクルをすべて選択します。すべてのパーティクルが手動で選択されたら、[トレーニングをアクティブ化]をクリックして学習を開始します。顕微鏡写真の残りの領域は自動的に選択されます。
選択したパーティクルを確認します。追加のパーティクルを含めるには、目的のパーティクルをクリックします。間違ったパーティクルを削除するには、Shift キーを押したまま、必要に応じてパーティクルをクリックします。
すべてのパーティクルが自動的に選択されたら、次の 4 つの顕微鏡写真を 1 つずつ選択して、代表的なトレーニング セットを作成します。選択した各顕微鏡写真の粒子が自動的に選択され、必要に応じて各顕微鏡写真が粒子を含むか除去するかをチェックします。トレーニングセットが取得されたら、[座標]をクリックして、選択したすべてのパーティクルの座標を保存します。
トレーニングセットを取得した後、xmipp3自動ピッキングを開いて、Xmippパーティクルピッキングの実行で以前の手動ピッキングを示し、顕微鏡写真を監視対象と同じに選択するように設定します。[実行]をクリックして、100,000 の座標のセットを生成します。コンセンサスアプローチを適用するには、スファイアクライオロピッキングを開き、事前処理された顕微鏡写真をピッキングモデルの入力顕微鏡写真としてデフォルトに設定します。
[信頼度のしきい値] を 0.3 に設定し、[ボックス サイズ] を 150 に設定して、[実行] をクリックします。このメソッドは、約 100,000 座標も生成する必要があります。次に、xmipp3 の深いコンセンサス ピッキングを開き、入力座標を設定して、スプハイヤー クライオロと xmipp3 の自動ピッキングの出力、事前トレーニング済みのモデルを選択するモデルの種類、およびトレーニング済みのモデルを使用して直接スキップトレーニングとスコアを [はい] にして 、[実行] をクリックします。
実行の最後で、[結果の分析] をクリックします。新しいウィンドウで、目のアイコンをクリックします。2 番目の新しいウィンドウが開き、すべてのパーティクルのリストが表示されます。
低い値は品質が悪いという指標であるため、列の Z スコア値は各パーティクルの品質に関する洞察を得ます。最高の Z スコアから最低の Z スコアにパーティクルを並べ替えるには、Xmipp Z スコアのディープ ラーニングをクリックし、Z スコアが 0.75 より大きいパーティクルを選択します。次に、[座標] をクリックして、約 50,000 座標の新しいサブセットを作成します。
解像度をローカルで計算するには、xmipp3 local MonoRes を開き、入力ボリュームを最後のリファインステップの出力に設定し、半分のボリュームを [はい] に、解像度の範囲を 1 ~ 10 オングストロームに設定します。パラメータが設定されたら、[実行]をクリックします。解像度が計算されたら、[結果の分析] をクリックし、[解像度ヒストグラムを表示] と [色付きスライスを表示] を選択します。
ボリュームの異なる部分の解像度が表示されます。構造の中央部のボクセルのほとんどは、3つのオングストロームの周りの解像度を表す必要がありますが、最悪の解像度は、構造の外側の領域で観察されます。3つのオングストロームの周りまたは下のピークを持つボクセルあたりの解像度のヒストグラムも表示されます。
シャープを適用するには、xmipp3 localdeblur シャープニングを開き、最後のリファインメント ステップの出力を入力マップとして選択し、解像度マップを取得 MonoRes マップに設定します。コマンドが実行されたら、[概要]タブで出力として生成されたボリュームのセットをダブルクリックします。各反復で生成されたボリュームをチェックできます。
また、3D でボリュームのフィーチャをよりよく観察するために、UCSF キメラなどの他のツールでボリュームを開くことをお勧めします。この図では、ナイキスト限界に非常に近い3つのオングストロームのフーリエシェル相関が観察される。図に示すように、再構築された 3D ボリューム スライスは、高度な詳細と明確に定義された構造を示します。
局所解析の後、中心ボクセルのほとんどは3つのオングストローム以下の分解能を達成します。ただし、ローカル解像度スライスの外側の領域は低解像度を示しますが、これらの領域内で観察されるブラーと一致します。後処理後、3Dマップボリュームの周波数が高く、詳細が明らかになっており、表現が改善されます。
達成された分解能が十分に高いと、構造の生化学的部分の一部も観察できる。得られた構造が低解像度で、より良いものへと進化することができない場合、フーリエシェル相関、解像度曲線、局所推定のヒストグラムが低いぼかし体積が観察される。選択後、2D 分類をチェックして、パーティクルの品質を評価できます。
たとえば、この分類では、粒子が騒がしい、不一分入っている、または結合されて、ピッキングが正しくないことを示します。最初のボリューム推定時に別のチェックポイントを実行できます。この例では、不正な推定が、メソッドの不適切な設定を使用して作成されました。
十分な解像度の 3D マップが作成されたら、次のステップはマップのアトミック モデルを提案することです。これは、モデリングプラグインを使用してScipion内で行うことができます。この技術は、生物学的高分子を再構成し、薬物設計の基礎として分子相互作用と生物学的アンサンブル機能を評価するためにうまく使用することができます。
