Scipion предоставляет инструменты для создания всего рабочего процесса обработки интегративным способом для анализа одной частицы в крио-ЭМ для достижения реконструкции биологического образца с высоким разрешением. Эта структура позволяет создавать рабочий процесс обработки с использованием нескольких пакетов обработки изображений, способствуя функциональной совместимости, прослеживаемости, воспроизводимости и комбинации информации, передаваемой различными методами, для получения более точного результата. Scipion постоянно растет, включая новые методы и упаковки.
Кроме того, он был распространен на криоэлектронную томографию и атомное моделирование, что позволило также создавать рабочие процессы для обработки этих данных. Чтобы создать проект в Scipion, нажмите кнопку Создать проект, чтобы создать проект. Чтобы импортировать фильмы микроскопа, выберите Импорт фильмов.
Появится новое окно. В этом окне введите путь к данным и установите напряжение микроскопа на 300 киловольт, сферическую аберрацию на два миллиметра, амплитудный контраст на 0,1, скорость увеличения на 50 000, режим частоты дискретизации на изображение от и размер пикселя на 1,34 ангстрема. Когда все параметры будут заданы, нажмите кнопку Выполнить.
Когда метод завершится, откройте вкладку Сводка нажмите кнопку Анализ результатов. Появится новое окно со списком выходных данных, сгенерированных методом. Чтобы запустить метод оптического потока для выравнивания роликов, откройте метод оптического выравнивания xmipp3, выберите импортированные фильмы в качестве входных фильмов и установите диапазон Кадров в ВЫРАВНИВАНИЕ от 2 до 13.
В разделе Дополнительные параметры установите для параметра Использовать предыдущее выравнивание ролика значение СУММ кадров значение No.Оставьте все остальные параметры равными значениям по умолчанию и выполните программу. Нажмите «Анализировать результаты», чтобы проверить полученные микроснимки и траекторию предполагаемых сдвигов. Для каждой микроснимки можно проверить спектральную плотность мощности, траектории, полученные для выравнивания фильма как по декартовым, так и по полярным координатам, а также название файла полученной микроснимки.
Обратите внимание, что частицы образца гораздо более заметны на микрофотографии по сравнению с одним кадром фильма. Для отбора частиц откройте метод ручного отбора xmipp3 и выберите ранее полученные микроснимки в качестве входных микроснимков. Нажмите кнопку Выполнить.
Появится новое интерактивное окно. В этом окне измените размер пикселя на 150. Выбранная микрофотография появится в большом окне.
Выберите все видимые частицы в пределах одной области. Когда все частицы будут выбраны вручную, нажмите активировать обучение, чтобы начать обучение. Остальные области микрофотографии будут выбраны автоматически.
Проверьте выбранные частицы. Чтобы включить дополнительную частицу, нажмите на интересующую ее частицу. Чтобы удалить неправильные частицы, удерживайте клавишу Shift и щелкните частицы по мере необходимости.
Когда все частицы будут автоматически отобраны, выберите следующие четыре микроснимка по одной, чтобы создать репрезентативный тренировочный набор. Частицы на каждой выбранной микрофотографии будут автоматически выбраны, проверяя каждую микрофотографию, чтобы включить или удалить частицы по мере необходимости. После получения обучающего набора щелкните Координаты, чтобы сохранить координаты всех выбранных частиц.
После получения обучающего набора откройте автоподбор xmipp3, чтобы указать предыдущий ручной отбор в процессе отбора частиц Xmipp, и установите параметр Микрофотографии для выбора в То же самое, что контролируется. Нажмите кнопку Выполнить, чтобы создать набор из примерно 100 000 координат. Чтобы применить консенсусный подход, откройте sphire cryolo picking и установите предварительно обработанные микроснимки в качестве входных микроснимков в модели комплектации по умолчанию.
Установите пороговое значение достоверности равным 0,3, а размер поля — 150, затем нажмите кнопку Выполнить. Метод также должен генерировать около 100 000 координат. Затем откройте глубокий выбор консенсуса xmipp3 и задайте входные координаты, чтобы включить выходные данные автоподбора sphire cryolo и xmipp3, выбрать тип модели для предварительного обучения и пропустить обучение и оценку непосредственно с предварительно обученной моделью в Да, затем нажмите кнопку Выполнить.
В конце выполнения нажмите кнопку Проанализировать результаты. В новом окне щелкните значок глаза. Откроется второе новое окно со списком всех частиц.
Значения Z-балла в столбце дадут представление о качестве каждой частицы, поскольку низкое значение свидетельствует о низком качестве. Чтобы упорядочить частицы от самого высокого к самому низкому Z-баллу, щелкните Xmipp Z-score глубокое обучение и выберите частицы с Z-баллом выше 0,75. Затем щелкните Координаты, чтобы создать новое подмножество с приблизительно 50 000 координат.
Чтобы вычислить разрешение локально, откройте локальные монорезы xmipp3 и установите входной том на выход последнего шага уточнения, Хотите ли вы использовать половинные тома в Yes, а Диапазон разрешения от 1 до 10 ангстрем. После задания параметров нажмите кнопку Выполнить. После вычисления разрешения нажмите «Анализировать результаты» и выберите «Показать гистограмму разрешения» и «Показать цветные фрагменты».
Будет показано разрешение в различных частях тома. Большинство вокселей центральных частей структур должны представлять собой разрешения вокруг трех ангстрем, в то время как худшие разрешения будут наблюдаться во внешних областях структур. Также будет показана гистограмма разрешений на воксель с пиком вокруг или ниже трех ангстрем.
Чтобы применить резкость, откройте xmipp3 localdeblur sharpening и выберите выходные данные последнего шага уточнения как Input Map, а также установите карту разрешения на карту получения MonoRes. После выполнения команды дважды щелкните набор томов, созданных в качестве выходных данных на вкладке Сводка. Тома, сгенерированные в каждой итерации, можно проверить.
Также рекомендуется открывать том с помощью других инструментов, таких как UCSF Chimera, чтобы лучше наблюдать за особенностями объема в 3D. На этом рисунке можно наблюдать корреляцию оболочки Фурье из трех ангстремов, которая очень близка к пределу Найквиста. Как показано на рисунке, реконструированные 3D-объемные срезы демонстрируют высокий уровень детализации и четко определенные структуры.
После локального анализа большинство центральных вокселей достигают разрешения ниже трех ангстрем. Однако внешние области локальных срезов разрешения демонстрируют более низкое разрешение, что согласуется с размытием, наблюдаемым в этих областях. После постобработки можно наблюдать более высокие частоты объема 3D-карты, раскрывая больше деталей и улучшая представление.
Когда достигнутое разрешение достаточно высокое, можно наблюдать даже некоторые биохимические части структуры. Если полученная структура имеет низкое разрешение и не может эволюционировать в лучшую, можно наблюдать размытый объем с низкой корреляцией оболочки Фурье, кривой разрешения и гистограммой локальной оценки. После отбора 2D-классификация может быть проверена для оценки качества частиц.
Например, в этой классификации частицы шумные, невведенные или связанные, что указывает на то, что выбор был неправильным. Еще одна контрольная точка может быть выполнена во время первоначальной оценки объема. В этом примере неправильная оценка была создана с использованием неправильной настройки метода.
После создания 3D-карты с достаточным разрешением следующим шагом является предложение атомной модели для карты. Это можно сделать в Scipion с помощью плагинов моделирования. Этот метод может быть использован для успешной реконструкции биологических макромолекул для оценки их молекулярных взаимодействий и функции биологического ансамбля в качестве основы для разработки лекарственного средства.
