从绵羊的成人和前卵巢收集的体外成熟卵母细胞的振动

长期储存后保持卵母细胞的潜在生存能力是一个极具机遇的工具，因为它将通过基因选择方案改善家畜繁殖，通过保护野生动物物种促进保护生物多样性，并增加生物技术研究。在育种程序的生成间隔中，幼卵母细胞的振动时间要短得多。超拉皮冷却和变暖的活化被认为是牛卵母细胞保存的标准方法。

然而，在绵羊中，这一程序仍然被认为是相对较新的，缺乏一种标准方法。在这段视频中，我们描述了一个从青少年和成年捐赠者那里收集的绵羊卵母细胞的玻璃化协议，以及冷冻保存前的体外成熟。该协议包括体外成熟、体外化、变暖和变暖后培养的所有程序。

恢复Cumulus卵母细胞复合物后，在体外成熟24小时，静态条件，包括幼卵母细胞，在成熟介质中补充百微摩尔的颤音。体外成熟后，卵母细胞通过在立体显微镜下轻轻管状和检查，机械地去除Cumulus细胞，放大60倍。选择在玻璃化程序中提交的卵母细胞是保证该程序成功应用的第一个重要步骤。

只有那些具有均匀的细胞质，脂质液滴的均匀分布，完整的所有艾玛宽和连续的关键在太空中，紧凑的Zana佩鲁西达的外径约19微米，并显示挤压的第一个极地体，因此在M2阶段，必须选择。使用最低基本音量方法，使用冷冻设备进行振动化。经过选择，一组5只幼细胞在38.5摄氏度的基介质下被调节两分钟。

卵母细胞然后脱水三分钟暴露在校准溶液。在所使用的玻璃化装置中加载卵母细胞是一个重要而关键的步骤。冷冻机使用连接到支架的聚丙烯条。

在这种方法中，玻璃化溶液中的卵母细胞，小于0点毫升，在薄膜条上迅速装上玻璃毛细管。然后必须去除溶液，留下足够薄的层，以覆盖细胞进行冷冻保存。在装入冷冻设备之前，在30秒内直接坠入液氮中。

为温度升高，每个玻璃化装置的含量从液氮转移到200微升滴减少的树叶糖溶液中。卵母细胞被转移集，拖着卵母细胞与薄，玻璃移液器，以促进去除细胞内低温保护剂。最后，卵母细胞在孵化器中以5%的二氧化碳在基质中预育。

变暖后，在变暖后文化的每个时间点，用100倍放大的倒显微镜对卵母细胞进行形态学评估。与变暖后膜完整性较低的卵母细胞相比，青少年捐赠者对卵母细胞的低温耐受性较低。在幼细胞中诱导的成熟介质中使用树纤维素，使膜完整性更高，提高了玻璃化后的存活率。

然而，幼卵母细胞的、受精和发育率并没有因补充纤维素而增加。与钙浓度振动的卵母细胞相比，使用钙浓度等于2.2毫克分升的介质进行幼细胞的玻璃化，应提高受精率，但未发现任何差异，从而产生。通过比较不同持续时间的后加热培养，我们表明，从老两口收集的 4 个小时的培养卵母细胞能够恢复能量键和微管设置，并恢复具有较高和爆破细胞浪费的发展能力。

与其他时间点相比，经过四个小时的加热后培养后，紫外线幼细胞的线粒体活动更高。线粒体分布离别在六个小时的后暖化文化中也发生了变化。此外，在升温后两小时的培养中，幼细胞内活性氧物种的细胞内水平明显较低，而后升温培养时为0、4和6小时。

然而，与其他卵母细胞不同，在幼细胞变暖后文化中，自发的异质活化率有所上升。建议方法的主要优点之一是它包括从卵母细胞收集到体外成熟、体外化和变暖的所有步骤。此外，它还包括一个加热后培养期，使卵母细胞能够从玻璃化过程中造成的损害中恢复过来。

选择最佳受精时间具有挑战性，并可能影响玻璃化计划的结果。还应考虑，与缓慢冻结不同，玻璃化是一种手动技术，因此取决于操作员。因此，一个主要的挑战是需要熟练的技术人员和研究人员在评估玻璃化方案的结果时考虑到操作者效应。

我们实验室的进一步研究将允许尝试标准化卵母细胞振动过程和选择，并更好地定制媒体组成，以满足幼卵母细胞的需要。我们无视文化和性格的使用以及抗氧化剂，提供了有希望的机会。