在此视频协议中，我们详细演示了一种培养牛卵母细胞的培养系统。该系统支持卵母细胞在培养中的可行性长达五天，并允许其分化。利用这种培养系统，可以生长从小蚂蚁卵泡中收集的卵母细胞，这些卵母细胞通常不用于生产体外的标准协议中，以增加可受精配子的可用性。
这种对更广泛保护区的开采，可以为受威胁物种、牛家族或面临遗传侵蚀风险的当地品种的遗传抢救提供新的选择。首先，准备15毫升的基本培养本，并按照手稿指示进行补充。接下来，准备三毫升的保持介质，添加五微摩尔西洛酰胺到基本培养基，并倒入35毫米培养皿。
根据手稿方向补充基本文化媒介，准备长IVCO介质。在 96 层涂层板的每个井中加入 200 微升长 IVCO 介质。然后用无菌水填充四个边缘，以补偿蒸发，并在培养过程中保持适当的湿度。
在38.5摄氏度和5%的二氧化碳下孵育96井板和保持介质，湿度最大。在无菌盐水中清洗卵巢四次，保持在26摄氏度。然后吸气所有直径超过两毫米的毛囊，用18个量表的针连接到吸气泵。
将吸气卵巢放在烧杯中，无菌盐水保持在26摄氏度。一次将一个卵巢放在无菌PTFE切割板上，并使用手术号22刀片切割1.5至2毫米厚的卵巢皮层，并平行于器官的主要轴。将卵巢皮层片放在无菌玻璃培养皿中，在38.5摄氏度的温盘中用解剖介质。
在60毫米玻璃培养皿中，用2到3毫升的M199D在解剖显微镜下，选择5至2毫米之间的卵泡。通过观察形态参数（如均匀明亮的半透明外观、广泛的血管化和常规的格兰努洛萨层）在立体显微镜下识别健康的非反应性毛囊。虽然阁楼毛囊具有灰色不透明的外观，并且血管化不良，内部有深色 COC。
丢弃阿克雷特毛囊，处理所有其他。使用手术刀片去除一侧毛囊周围的卵巢组织，直到其暴露。然后使用 26 量表针小心地在暴露的卵泡壁中进行一个缝隙，从而释放包括 COC、卵泡液和细胞团块的卵泡含量。
识别 COC 并检查其积原完整性、zona pellucida 完整性和细胞质的同质性。如果符合这些标准，则使用 P20 移液器吸气 COC。将隔离的 COC 与 M199D 西罗斯塔米德进行分离，然后继续隔离程序 30 分钟。
选择COC后，如前所述，在60毫米培养皿中用20微升的M199D西洛斯塔米德准备16滴，并在每滴中放入一个健康的COC。使用连接到相机的倒置显微镜测量卵母细胞直径，不包括佐纳佩普西达。通过清晰的卵母细胞可视化，进行两次垂直测量，确保两次测量的平均值在 100 到 110 微米的范围内。
由于伴生积细胞，很难精确测量卵母细胞直径。具有直径较小或较大的卵母细胞，或没有圆形卵母细胞的COC，或具有无法测量的卵母细胞的COC应丢弃。将选定的 COC 转移到含有 M199H 介质的 35 毫米培养皿中，并在 38.5 摄氏度和 5%的二氧化碳中保持最大湿度，确保总工作时间不超过两小时。
一旦选择和收集程序完成，将一个COC转移到以前准备的96井板的每个井的中心。在38.5摄氏度和5%的二氧化碳最大湿度下孵育5天，每隔一天刷新一次。要更新介质，请用 100 微升的新鲜长 IVCO 介质更换 100 微升旧介质，请使用立体显微镜进行更换，以避免移动 COC。
在长IVCO结束时，分析COC形态。如果他们有一个紧凑的积子细胞投资没有积血扩张的迹象，或细胞退化，将它们分类为一类。如果 COC 具有紧凑的积子细胞投资，没有积率膨胀或细胞退化的迹象，并且具有一个或多个类状的形成，则将它们分类为第二类。
第三类COC，显示几层积细胞，没有积血扩张的迹象，一些分类细胞在外层积血细胞和没有蚂蚁样的形成。如果COCs显示大量积细胞损失超过卵母细胞表面的50%，以及细胞退化和细胞碎片的迹象，则将其归类为第四类。在长IVCO结束时，COC的形态发生了变化。
根据积细胞的外观确定了四个类。总的来说，对5个生物复制体中的74个卵母细胞进行了分析，其中9.45%在进一步评估中被丢弃。第一类、第二类和三类被判定为健康，而第四类则表现出明显的退化迹象，例如卵母细胞周围没有完整的积细胞层。
这些 COC 被认为不适合在未来的 IVP 环境中进行下游程序。在长IVCO结束时对卵母细胞的评估表明，在未成熟阶段，仍有更高比例的卵母细胞被逮捕，而染色质仍被封闭在GV内。当GV内的染色质凝结被调查为能力提升的标志时，在59%的卵母细胞中观察到染色质配置向更浓缩的阶段（即GV 2和GV 3）的过渡。一小部分恢复性，达到元相一个阶段，或退化。
这些结果表明，L-IVCO培养支持卵母细胞的生存能力，同时防止五天期复生。在长IVCO结束时，COC可用于体外胚胎生产的下游程序，即体外成熟、受精和胚胎培养。这些步骤是必要的，以提供概念证明，卵母细胞已经获得了更高的发展能力。
除了拥有增加受精卵母细胞数量的潜力外，长IVCO培养系统对于有兴趣解剖调节能力游戏体形成的细胞和分子过程的科学家来说，也是一种工具。
