从小鼠肩胛间棕色脂肪组织中分离棕色脂肪细胞以进行基因和蛋白质表达分析

为了研究棕色脂肪组织的生物学方面，必须清除纯化的棕色脂肪大小。目前没有棕色脂肪大小的纯化和质量可用。在这项研究中，我们开发了一个简单的协议来解决这个问题。

现在，此协议需要一项技能。与其他方法相比，它需要的研究材料少得多，纯化的棕色脂肪大小可以直接用于基因和蛋白质表达分析。该协议为研究经典棕色脂肪大小的生物学提供了一种新方法。

它也可以应用于研究白色脂肪细胞褐变过程。演示该程序的将是我实验室的研究助理阿曼达。首先将装有BAT和消化溶液的烧瓶放在磁力搅拌器上，在35摄氏度的培养箱中以每分钟60转的速度放置30分钟。

使用一毫升移液器破坏搅拌棒周围BAT切片的聚集组织团块。消化后，将70微米的过滤器放在干净的50毫升离心管顶部，并通过过滤器移取约4毫升的细胞悬液。然后用四毫升12%碘沙醇溶液洗涤。

上下移液，将细胞与碘沙醇溶液混合，然后将细胞混合物转移到两个透明的五毫升聚苯乙烯试管中。将含有细胞混合物的聚苯乙烯管放在冰上一小时，使BA在顶部形成一层。取出20微升分离的BA进行显微镜检查。

对于RNA和蛋白质分离，将BA层移液到两个1.7毫升微中心离心管中。然后小心地去除过量的碘溶液，而不会破坏BA层。然后将一毫升TRIzol加入细胞溶液中，以同时分离RNA，DNA和蛋白质，并充分混合以裂解细胞。

为了分离相，加入200微升氯仿，并在4摄氏度下以9， 981 G离心10分钟。离心后，使用水相进行RNA分离。将300微升有机相转移到两毫升微量离心管中，并加入750微升100%乙醇。

涡旋10秒后，加入200微升1-溴-3-氯丙烷，再次涡旋10秒。在涡旋10秒钟之前加入600微升双蒸水。让混合溶液在室温下静置10分钟。

离心后，在4摄氏度下加入9， 981 G10分钟。这些相将被分离，蛋白质相位于中间层。除去顶部的水溶液，并在剩余的溶液中加入一毫升100%乙醇。

在4摄氏度下以9，981G离心10分钟后，弃去上清液并用一毫升100%乙醇洗涤沉淀。在 9， 981 G 下在 4 摄氏度下离心 10 分钟。除去上清液后，在室温下风干沉淀10分钟并测量湿沉淀的重量。

以每毫克颗粒20微升的比例加入1%SDS溶液。通过将试管放入 55 摄氏度和 11 G 的加热摇床中 5 到 10 分钟，将沉淀完全溶解。在该协议中，含有3%BSA的PBS用于将BA与BAT分开。

分离的细胞是覆盆子形的，内部有多房脂滴，并且是tdTom阳性，确认它们是BA。使用改进的GTPC方案从BA中分离蛋白质，然后用SDS-PAGE凝胶进行检查。在BA样品中观察到与BSA相关的显性条带，表明其干扰蛋白质提取。

为了避免BSA干扰，使用6%碘氧溶液分离BAs，BAs具有典型的覆盆子形状并含有多房脂滴。从这些BA中提取的蛋白质在SDS-PAGE凝胶中得到很好的分离。发现这些细胞是tdTomato阳性，而从沉淀中回收的细胞是tdTomato阴性，没有明显的脂滴，表明BAs与非脂肪细胞有效分离。

在基因表达分析中，分离的BA中UCP1和PDGFA的mRNA水平显着升高。但PDGFRA的mRNA仅在BAT中检测到。在分离的BA中发现富集的UCP1蛋白。

EDGFR alpha在BAT中检测到，但在孤立的BA中未检测到。这些结果证实了该方法分离BA的有效性，并证明分离的BA适用于基因和蛋白质表达研究。尝试此方案时，请使用新鲜消化缓冲液解离棕色脂肪组织，并避免在消化期间形成组织团块。

这种新方法使得在单个细胞抽样水平上研究棕色脂肪组织的生物学变得容易。通过应用这种方法，可以用纯棕色脂肪细胞精确解剖棕色脂肪细胞基因表达程序进行GN和蛋白质表达研究，而不必担心最初来自非脂肪细胞的污染。