Para investigar os aspectos biológicos do tecido adiposo marrom, é essencial limpar o tamanho adiposo marrom purificado. Atualmente não veio na purificação de tamanho adiposo marrom e as massas estão disponíveis. Neste estudo, desenvolvemos um protocolo simples para abordar essa questão.
Agora, uma habilidade é necessária para este protocolo. Ele precisa de muito menos materiais de estudo do que outros métodos e o tamanho adiposo marrom purificado pode ser usado diretamente para análise de expressão gênica e proteica. Este protocolo fornece um novo método para estudar a biologia do tamanho adiposo marrom clássico.
Também pode ser aplicado para estudar o processo de escurecimento dos adipócitos brancos. Demonstrando o procedimento estará Amanda, uma assistente de pesquisa do meu laboratório. Comece por colocar o balão com MTD e solução de digestão num agitador magnético a 60 rotações por minuto numa incubadora de 35 graus Celsius durante 30 minutos.
Use uma pipeta de um mililitro para interromper os aglomerados de tecido agregados de fatias de MTD ao redor da barra do agitador. Após a digestão, coloque um filtro de filtro de 70 micrômetros em cima de um tubo de centrífuga limpo de 50 mililitros e pipeta em torno de quatro mililitros de suspensão celular através do filtro. Em seguida, lave-o com quatro mililitros de solução de iodixanol a 12%.
Pipetar para cima e para baixo para misturar as células com solução de iodixanol e, em seguida, transferir a mistura celular para dois tubos de ensaio de poliestireno de cinco mililitros transparentes. Coloque os tubos de poliestireno contendo a mistura celular no gelo por uma hora, fazendo com que os BAs formem uma camada no topo. Retirar 20 microlitros dos BAs isolados para exame microscópico.
Para isolamento de RNA e proteína, pipete a camada de BA em dois tubos de microcenterfuge de 1,7 mililitro. Em seguida, remova cuidadosamente a solução iodixonal excessiva sem interromper a camada de BA. Em seguida, adicione um mililitro de TRIzol na solução celular para isolar simultaneamente RNA, DNA e proteína e misture o suficiente para lisar as células.
Para separar as fases, adicione 200 microlitros de clorofórmio e centrífuga ao tubo a 9, 981 G por 10 minutos a quatro graus Celsius. Após a centrifugação, use a fase aquosa para isolamento de RNA. Transfira 300 microlitros da fase orgânica para um tubo de microcentrífuga de dois mililitros e adicione 750 microlitros de etanol a 100%.
Após o vórtice por 10 segundos, adicione 200 microlitros de 1-Bromo-3-cloropropano e vórtice novamente por 10 segundos. Adicione 600 microlitros de água destilada dupla antes de vórtice por 10 segundos. Deixar repousar a solução misturada durante 10 minutos à temperatura ambiente.
Após a centrifugação, adicionar 9.981 G por 10 minutos a quatro graus Celsius. As fases serão separadas com a fase proteica localizada na camada intermediária. Remova a solução aquosa superior e adicione um mililitro de etanol a 100% na solução restante.
Após centrifugação a 9, 981 G por 10 minutos a quatro graus Celsius, descarte o sobrenadante e lave o pellet com um mililitro de etanol a 100%. Centrífuga a 9, 981 G por 10 minutos a quatro graus Celsius. Depois de remover o sobrenadante, seque o pellet ao ar por 10 minutos à temperatura ambiente e meça o peso do pellet molhado.
Adicionar solução de SDS a 1% a uma proporção de 20 microlitros por miligrama de pellet. Dissolva o pellet completamente colocando o tubo em um agitador aquecido a 55 graus Celsius e 11 G por cinco a 10 minutos. No protocolo, PBS contendo 3%BSA foi utilizado para separar BAs de BATs.
As células isoladas eram em forma de framboesa com gotículas lipídicas multiloculares no interior e eram tdTom positivas, confirmando que eram BAs. A proteína foi isolada dos BAs com um protocolo GTPC melhorado e, em seguida, foi examinada com um gel SDS-PAGE. Uma banda dominante associada à ASC foi observada na amostra de BA, sugerindo sua interferência na extração proteica.
Para evitar a interferência da ASC, uma solução iodixonal a 6% foi utilizada para o isolamento de BAs, que tinham uma forma típica de framboesa e continham gotículas lipídicas multiloculares. As proteínas extraídas desses BAs foram bem separadas no gel SDS-PAGE. Essas células foram consideradas tdTomato positivas, enquanto as células recuperadas do pellet foram tdTomato negativas, sem gotículas lipídicas óbvias, sugerindo uma separação eficiente dos BAs das células sem gordura.
Na análise da expressão gênica, os níveis de mRNA de UCP1 e PDGFA foram significativamente maiores nos BAs isolados. Mas o mRNA do PDGFRA só foi detectado em BAT. A proteína UCP1 foi encontrada enriquecida em BAs isolados.
O EDGFR alfa foi detectado em MTD, mas não em BAs isolados. Esses resultados confirmam a eficiência do método de isolamento de BAs e demonstram que os BAs isolados são adequados para estudos de expressão gênica e proteica. Ao tentar este protocolo, use tampão de digestão fresco para dissociar o tecido adiposo marrom e evitar a formação de aglomerados de tecido durante o período de digestão.
Este novo método facilita a investigação da biologia do tecido adiposo marrom em um único nível de torneira celular. Aplicando este método, pode-se realizar estudos de GN e expressão de proteínas com adipócitos marrons puros dissecando com precisão o programa de expressão gênica de adipócitos marrons, sem se preocupar com a contaminação originária de células não gordurosas.
