Per studiare gli aspetti biologici del tessuto adiposo bruno, è essenziale eliminare le dimensioni adipose brune purificate. Attualmente non è venuto in purificazione di dimensioni adipose brune e le masse sono disponibili. In questo studio, abbiamo sviluppato un protocollo semplice per affrontare questo problema.
Ora, sono richieste competenze per questo protocollo. Ha bisogno di molti meno materiali di studio rispetto ad altri metodi e la dimensione adiposa bruna purificata può essere utilizzata direttamente per l'analisi dell'espressione genica e proteica. Questo protocollo fornisce un nuovo metodo per studiare la biologia della classica dimensione adiposa bruna.
Può anche essere applicato per studiare il processo di imbrunimento degli adipociti bianchi. A dimostrare la procedura sarà Amanda, un'assistente di ricerca del mio laboratorio. Iniziare posizionando il pallone con BAT e soluzione di digestione su un agitatore magnetico a 60 rotazioni al minuto in un incubatore a 35 gradi Celsius per 30 minuti.
Utilizzare una pipetta da un millilitro per interrompere i grumi di tessuto aggregato di fette BAT attorno alla barra dell'agitatore. Dopo la digestione, posizionare un filtro filtrante da 70 micrometri sopra un tubo di centrifuga pulito da 50 millilitri e pipettare circa quattro millilitri di sospensione cellulare attraverso il filtro. Quindi lavarlo con quattro millilitri di soluzione di iodixanolo al 12%.
Pipettare su e giù per mescolare le cellule con la soluzione di iodixanolo, quindi trasferire la miscela di cellule in due provette di polistirene trasparente da cinque millilitri. Posizionare i tubi di polistirene contenenti la miscela cellulare sul ghiaccio per un'ora, facendo sì che i BA formino uno strato sulla parte superiore. Estrarre 20 microlitri dei BA isolati per l'esame al microscopio.
Per l'isolamento di RNA e proteine, pipettare lo strato di BA in due tubi microcenterfuge da 1,7 millilitri. Quindi rimuovere con attenzione la soluzione iodissonale eccessiva senza interrompere lo strato BA. Quindi aggiungere un millilitro di TRIzol nella soluzione cellulare per isolare simultaneamente RNA, DNA e proteine e mescolare sufficientemente per licare le cellule.
Per separare le fasi, aggiungere 200 microlitri di cloroformio e centrifugare al tubo a 9.981 G per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Dopo la centrifugazione, utilizzare la fase acquosa per l'isolamento dell'RNA. Trasferire 300 microlitri della fase organica in un tubo di microcentrifuga da due millilitri e aggiungere 750 microlitri di etanolo al 100%.
Dopo il vortice per 10 secondi, aggiungere 200 microlitri di 1-Bromo-3-cloropropano e vortice di nuovo per 10 secondi. Aggiungere 600 microlitri di acqua doppia distillata prima di vorticare per 10 secondi. Lasciare riposare la soluzione miscelata per 10 minuti a temperatura ambiente.
Dopo la centrifugazione, aggiungere 9.981 G per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Le fasi saranno separate con la fase proteica localizzata nello strato intermedio. Rimuovere la soluzione acquosa superiore e aggiungere un millilitro di etanolo al 100% nella soluzione rimanente.
Dopo la centrifugazione a 9.981 G per 10 minuti a quattro gradi Celsius, scartare il surnatante e lavare il pellet con un millilitro di etanolo al 100%. Centrifugare a 9, 981 g per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Dopo aver rimosso il surnatante, asciugare all'aria il pellet per 10 minuti a temperatura ambiente e misurare il peso del pellet umido.
Aggiungere la soluzione SDS all'1% con un rapporto di 20 microlitri per milligrammo di pellet. Sciogliere completamente il pellet mettendo il tubo in uno shaker riscaldato a 55 gradi Celsius e 11 G per cinque o 10 minuti. Nel protocollo, PBS contenente il 3% di BSA è stato utilizzato per separare i BA dai BAT.
Le cellule isolate erano a forma di lampone con goccioline lipidiche multiloculari all'interno ed erano tdTom positive, confermando che erano BA. La proteina è stata isolata dai BA con un protocollo GTPC migliorato ed è stata quindi esaminata con un gel SDS-PAGE. Una banda dominante associata alla BSA è stata osservata nel campione di BA, suggerendo la sua interferenza nell'estrazione delle proteine.
Per evitare l'interferenza BSA, è stata utilizzata una soluzione iodissonale al 6% per l'isolamento dei BA, che avevano una tipica forma a lampone e contenevano goccioline lipidiche multiloculari. Le proteine estratte da questi BA erano ben separate nel gel SDS-PAGE. Queste cellule sono risultate essere tdTomato positive mentre le cellule recuperate dal pellet erano tdTomato negative senza evidenti goccioline lipidiche, suggerendo un'efficiente separazione dei BA dalle cellule non adipose.
Nell'analisi dell'espressione genica, i livelli di mRNA di UCP1 e PDGFA erano significativamente più alti nei BA isolati. Ma l'mRNA di PDGFRA è stato rilevato solo in BAT. La proteina UCP1 è stata trovata arricchita in BA isolati.
EDGFR alfa è stato rilevato in BAT, ma non in BA isolati. Questi risultati confermano l'efficacia del metodo per isolare i BA e dimostrano che i BA isolati sono adatti per studi di espressione genica e proteica. Quando si tenta questo protocollo, utilizzare un tampone di digestione fresco per dissociare il tessuto adiposo bruno ed evitare la formazione di grumi di tessuto durante il periodo di digestione.
Questo nuovo metodo rende facile studiare la biologia del tessuto adiposo bruno su un livello di rubinetto di una singola cellula. Applicando questo metodo, è possibile eseguire studi di espressione di GN e proteine con adipociti bruni puri che sezionano con precisione il programma di espressione genica degli adipociti bruni, senza preoccuparsi della contaminazione originariamente da cellule non adipose.
