Kahverengi yağ dokusunun biyoloji yönlerini araştırmak için, saflaştırılmış kahverengi yağ boyutunu temizlemek önemlidir. Şu anda kahverengi yağ büyüklüğünde saflaştırma yapılmadı ve kütleler mevcut. Bu çalışmada, bu konuyu ele almak için basit bir protokol geliştirdik.
Şimdi, bu protokol için bir beceri gereklidir. Diğer yöntemlerden çok daha az çalışma materyaline ihtiyaç duyar ve saflaştırılmış kahverengi yağ boyutu doğrudan gen ve protein ekspresyon analizi için kullanılabilir. Bu protokol, klasik kahverengi yağ boyutunun biyolojisini incelemek için yeni bir yöntem sağlar.
Beyaz adipositlerin kahverengileşme sürecini incelemek için de uygulanabilir. Prosedürü gösteren, laboratuvarımdan bir araştırma görevlisi olan Amanda olacak. BAT ve sindirim çözeltisi içeren şişeyi, 35 santigrat derecelik bir inkübatörde dakikada 60 dönüşte manyetik bir karıştırıcıya 30 dakika boyunca yerleştirerek başlayın.
Karıştırıcı çubuğunun etrafındaki BAT dilimlerinin toplanmış doku kümelerini bozmak için bir mililitrelik pipet kullanın. Sindirimden sonra, 50 mililitrelik temiz bir santrifüj tüpünün üzerine 70 mikrometrelik bir süzgeç filtresi yerleştirin ve süzgeçten yaklaşık dört mililitre hücre süspansiyonu pipet yerleştirin. Daha sonra dört mililitre% 12 iyodiksanol çözeltisi ile yıkayın.
Hücreleri iyotlaksanol çözeltisi ile karıştırmak için yukarı ve aşağı pipetleyin, ardından hücre karışımını iki şeffaf beş mililitrelik polistiren test tüpüne aktarın. Hücre karışımını içeren polistiren tüpleri bir saat boyunca buz üzerine yerleştirin ve BA'ların üstte bir tabaka oluşturmasına neden olun. Mikroskop incelemesi için izole edilmiş BA'ların 20 mikrolitresini çıkarın.
RNA ve protein izolasyonu için, BA tabakasını iki adet 1.7 mililitrelik mikrocenterfuge tüpüne pipetleyin. Ardından, BA tabakasını bozmadan aşırı iyodiksonal çözeltiyi dikkatlice çıkarın. Daha sonra RNA, DNA ve proteini aynı anda izole etmek için hücre çözeltisine bir mililitre TRIzol ekleyin ve hücreleri lize etmek için yeterince karıştırın.
Fazları ayırmak için, tüpe dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 9.981 G'de 200 mikrolitre kloroform ve santrifüj ekleyin. Santrifüjlemeden sonra, RNA izolasyonu için sulu fazı kullanın. Organik fazın 300 mikrolitresini iki mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve 750 mikrolitre% 100 etanol ekleyin.
10 saniye boyunca vorteksten sonra, 200 mikrolitre 1-Bromo-3-kloropropan ekleyin ve 10 saniye boyunca tekrar vorteks ekleyin. 10 saniye boyunca vortekslemeden önce 600 mikrolitre çift damıtılmış su ekleyin. Karışık çözeltinin oda sıcaklığında 10 dakika bekletin.
Santrifüjlemeden sonra, dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 9.981 G ekleyin. Fazlar, orta tabakada lokalize olan protein fazı ile ayrılacaktır. Üst sulu çözeltiyi çıkarın ve kalan çözeltiye bir mililitre% 100 etanol ekleyin.
Dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 9, 981 G'de santrifüjlemeyi takiben, süpernatantı atın ve peleti bir mililitre% 100 etanol ile yıkayın. Dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 9.981 G'de santrifüj. Süpernatanı çıkardıktan sonra, pelet oda sıcaklığında 10 dakika boyunca hava ile kurutun ve ıslak peletin ağırlığını ölçün.
Pelet miligramı başına 20 mikrolitre oranında %1 SDS çözeltisi ekleyin. Tüpü beş ila 10 dakika boyunca 55 santigrat derece ve 11 G'de ısıtılmış bir çalkalayıcıya koyarak peleti tamamen çözün. Protokolde, BA'ları BAT'den ayırmak için %3 BSA içeren PBS kullanılmıştır.
İzole edilen hücreler, içinde multiloküler lipid damlacıkları ile ahududu şeklindeydi ve tdTom pozitifti ve BA olduklarını doğruladı. Protein, geliştirilmiş bir GTPC protokolü ile BA'lardan izole edildi ve daha sonra bir SDS-PAGE jeli ile incelendi. BA örneğinde BSA ile ilişkili baskın bir bant gözlendi ve bu da protein ekstraksiyonuna girişimini düşündürdü.
BSA girişimini önlemek için, tipik bir ahududu şekline sahip olan ve çok loküler lipit damlacıkları içeren BA'ların izolasyonu için% 6'lık bir iyodiksonal çözelti kullanıldı. Bu BA'lardan ekstrakte edilen proteinler SDS-PAGE jelinde iyi ayrıldı. Bu hücrelerin tdDomates pozitif olduğu bulunurken, peletten geri kazanılan hücreler belirgin lipit damlacıkları olmadan tdDomates negatifti, bu da BA'ların yağ olmayan hücrelerden etkili bir şekilde ayrıldığını düşündürmektedir.
Gen ekspresyon analizinde, UCP1 ve PDGFA'nın mRNA seviyeleri izole BA'larda anlamlı derecede yüksekti. Ancak PDGFRA'nın mRNA'sı sadece BAT'de tespit edildi. UCP1 proteini izole BA'larda zenginleştirilmiş olarak bulundu.
EDGFR alfa BAT'ta tespit edildi, ancak izole BA'larda tespit edilmedi. Bu sonuçlar, BA'ları izole etme yönteminin etkinliğini doğrulamakta ve izole edilen BA'ların gen ve protein ekspresyon çalışmaları için uygun olduğunu göstermektedir. Bu protokolü denerken, kahverengi yağ dokusunu ayrıştırmak ve sindirim döneminde doku kümelenmesi oluşumunu önlemek için taze sindirim tamponu kullanın.
Bu yeni yöntem, kahverengi yağ dokusunun biyolojisini tek bir hücre musluk seviyesinde araştırmayı kolaylaştırır. Bu yöntemi uygulayarak, orijinal olarak yağsız hücrelerden kontaminasyon konusunda endişelenmeden, kahverengi adipositler gen ekspresyon programını hassas bir şekilde diseke eden saf kahverengi adipositlerle GN ve protein ekspresyon çalışmaları yapılabilir.
