新生小鼠肩胛间脂肪组织基质血管部分棕色脂肪细胞的分化和成像

该方案允许有效和可重复地分化表达关键脂肪生成转录因子，成熟脂肪细胞标志物的棕色脂肪细胞，并具有成熟棕色脂肪细胞的产热电位和形态表型。这是一种简单且可复制的两阶段分化程序，可从新生小鼠的肩胛间棕色脂肪组织中获得具有成熟棕色脂肪细胞特征的细胞。该协议允许研究棕色脂肪组织的激活机制作为治疗肥胖的靶点。

它一直是确定脂肪营养不良病理生理学机制的模型。首次执行这种技术预计会很有挑战性。必须有一个详细的协议并强调关键点，以获得成功的结果。

首先，将安乐死的小鼠置于俯卧位，并使用锋利的剪刀在动物背部的中部做一个一厘米长的皮肤切口。小心地去除皮肤，使用小剪刀通过手术将iBAT从胴体上分离。使用曲线尖钳收获两个 iBAT 裂片，以独立移除裂片。

在室温下将两个裂片放入装有 1.5 毫升无菌 PBS 的塑料管中。将 iBAT 组织在 37 摄氏度的胶原酶 2 型消化缓冲液中孵育 45 分钟，以 800 RPM 的速度连续轻轻摇动。通过使用P1000微量移液器和过滤器吸头上下移液，机械地破坏胶原酶二型消化缓冲液中的组织悬浮液。

为每个样品使用新的吸头。将解离的组织通过单独的 100 微米细胞过滤器放入新的 1.5 毫升管中。向过滤的组织样本中加入 500 微升 ACK 缓冲液。

将试管倒置四到五次，并在室温下孵育四分钟。然后使用 P1000 微量移液器和过滤吸头将悬浮液通过 40 微米细胞过滤器放入新的 1.5 毫升管中。离心使颗粒重悬，如文本手稿中所述。

然后通过向每个孔中加入一毫升悬浮液，将每个样品接种到 24 孔培养板的六个孔中。未分化的前脂肪细胞表现出非常低或无法检测到的 ppar-γ、C/ebp-α、perilipin 1 和 CD36 水平。相比之下，这些标志物在分化的第七天明显更高。

棕色前脂肪细胞中多个脂滴的积累与先前发表的结果一致。在分化第 7 天，观察到线粒体质量标志物 TOM 20 和氧化磷酸化复合物蛋白水平显着增加。UCP1 是该细胞类型的真正标志物，在未分化的前脂肪细胞中未检测到，而在分化的第 7 天，它在成熟的棕色脂肪细胞中大量表达。

线粒体从第0天的细长管状进化到第七天的圆形或豆状。线粒体内部结构也通过脂肪生成而改变，导致平行堆积的 crystae 密度更高。重要的是，线粒体与分化的棕色脂肪细胞中的脂滴密切相关，因此即使使用高分辨率透射电子显微镜，也无法检测到线粒体外膜与脂滴表面之间的明显距离。

肩胛间脂肪组织的手术切除至关重要。组织数量低下限制了将要分化的细胞的可用性。这种成像技术有助于在体外表征分化的棕色脂肪细胞的形态。

可以进行线粒体功能、β 雄激素激活和自噬抑制的检测。