在微加工微流体平台中生成简化的三维芯片皮肤模型

这是一种新颖的、无光刻的协议，用于使用微加工的粘性乙烯基层和用于真皮室生成的平行流动方法对3D芯片皮肤进行建模。微加工乙烯基在制造过程中提供了更简单的工艺，在器件的布局中提供了多功能性，克服了PDMS和传统光刻方法的一些局限性。这种多层片上皮肤可用于药物和化妆品测试方法，因为它允许以较低的成本进行高通量筛选，并可用于对多种疾病进行建模。

首先使用Brother Canvas Workspace软件设计微流控芯片。创建一个 30 x 30 厘米的工作空间，并在将其存储在 svg 文件中之前，用芯片不同层的设计模式填充它。剪切 30 x 30 厘米的乙烯基板。

将其粘贴到低粘性粘合剂垫上，并根据需要消除所有气泡。使用 USB 驱动器，将 svg 文件上传到边缘绘图仪，并将切割参数设置为零级切割压力、三级切割刀片和一级切割速度。设置参数后，将带有乙烯基的粘合垫放入绘图仪中，然后开始在95微米厚的乙烯基上切割通道图案的过程。

使用对准器组装整个设备，以正确调整通道、入口和出口。用相应的微型机器设计堆积乙烯基层，用于组装下部通道，保持底层的盖带以避免粘在对准器上。将聚碳酸酯多孔膜切割并放置在下通道的顶部，而不覆盖入口。

添加10个具有上腔室设计的乙烯基层，并在顶部粘贴双面胶带最后一层。从对准器中取出芯片，将其粘贴在载玻片上。将两毫米厚的 PDMS 纸放在双面胶带乙烯基层的顶部。

为确保芯片完全防水，请在芯片顶部放置一个砝码过夜。第二天，用70%乙醇冲洗芯片五分钟，然后用蒸馏水清洗芯片，对芯片进行灭菌。将泵一和泵二分别连接到上腔入口一和上腔入口两。

将泵三连接到下腔室入口，然后将上腔和下腔出口连接到废液桶。使用 PTFE 管和 18 号不锈钢连接器将注射器连接到每个入口。泵PBS用泵三通过下腔入口，每分钟50微升，用泵两通过上腔进气口，每分钟100微升。

然后，将纤维蛋白原预凝胶加载注射器，立即将其放入泵中，并以每分钟200微升的速度运行。一旦预凝胶从上腔室出口出来，停止泵一泵和泵二泵，然后在不取下管子的情况下，离开芯片以允许在37摄氏度下凝胶化10分钟。凝胶化后，用盖子堵住上腔入口，并将培养基泵入上腔入口2，泵三，每小时50微升过夜。

在生成真皮隔室24小时后，检查人原代成纤维细胞是否在组装体中扩散，然后通过上通道入口2以每分钟40微升的速度引入5次10至6 HKCs，每毫升1分钟。对于细胞附着，将芯片在37摄氏度下在湿度饱和的培养箱中放置过夜。开始用泵三泵泵新鲜培养基，仅通过下腔室入口，每分钟50微升。

在代表性分析中，显示沿组件上腔的水凝胶高度。牺牲PBS和预凝胶的平均高度为550微米，在100和200微升/分钟的流速下，凝胶的功能是最佳的。未能通过下通道冲洗PBS导致凝胶的理论高度与被测高度之间的差异，相差40%从平行流方案启动24小时后，发现人类原发成纤维细胞成功地在组装上腔的纤维蛋白凝胶中扩散， 之后，绿色荧光蛋白表达HKCs可以有效地接种在水凝胶的顶部。

去除管子而不保持系统关闭过夜以允许HKCS沉淀导致细胞不均匀，汇合的单层细胞。微流控芯片中未分化皮肤模型的3D共聚焦分析清楚地显示了将顶部的HKCs与嵌入底部的成纤维细胞分开的水凝胶表面。生成的皮肤可以暴露于空气/液体界面以获得成熟和分化的表皮，并使用几种真皮和表皮标志物进一步表征。

该技术允许更快，更便宜的设备制造，并使用微流体生成多层皮肤，为药物和化妆品测试提供更现实的方法。