Este é um novo protocolo, livre de litografia para modelar um skin-on-chip 3D usando camadas de vinil micromachined, adesivo e uma metodologia de fluxo paralelo para a geração de compartimentos dérmicos. O vinil micromaquinado proporciona mais simplicidade no processo de fabricação e versatilidade no layout do dispositivo, superando algumas das limitações do PDMS e das abordagens tradicionais de litografia. Este skin-on-a-chip multicamadas pode ser usado para abordagens de testes medicamentosos e cosméticos, uma vez que permite a triagem de alto rendimento a custos mais baixos e poderia ser usado para modelar várias doenças.
Comece projetando um chip microfluido usando o software Brother Canvas Workspace. Crie um espaço de trabalho de 30 por 30 centímetros e preencha-o com os padrões de design para as diferentes camadas do chip antes de armazená-lo em um arquivo svg. Corte as folhas de vinil de 30 por 30 centímetros.
Coloque-o em um tapete adesivo de baixa aderência e elimine todas as bolhas de ar, conforme necessário. Usando uma unidade USB, carregue o arquivo svg para o plotter de borda, e defina os parâmetros de corte como pressão de corte no nível zero, lâmina de corte no nível três e nível um para a velocidade de corte. Quando os parâmetros forem definidos, coloque o tapete adesivo com o vinil no plotador e inicie o processo de corte dos padrões do canal em vinil de 95 micrômetros de espessura.
Monte todo o dispositivo usando um alinhador para canais de ajuste adequados, entradas e tomadas. Empilhe camadas de vinil com um design de micrometralhadora correspondente para a montagem do canal inferior, mantendo a fita de cobertura da camada inferior para evitar grudar no alinhador. Corte e coloque a membrana porosa de policarbonato em cima do canal inferior sem cobrir as entradas.
Adicione 10 camadas de vinil com o design da câmara superior e coloque uma camada final de fita de dois lados na parte superior. Remova o chip do alinhador para enfiá-lo na lâmina de vidro. Coloque uma folha PDMS de dois milímetros de espessura em cima da camada de vinil de fita dupla face.
Para garantir que o chip esteja completamente impermeável, deixe um peso em cima do chip durante a noite. No dia seguinte, esterilize o chip lavando-o com 70% de etanol por cinco minutos, seguido de uma lavagem com água destilada. Conecte a bomba um e bombeie dois para a entrada da câmara superior um e a entrada da câmara superior dois, respectivamente.
Conecte a bomba três à entrada da câmara inferior e, em seguida, conecte a câmara superior e as saídas de câmara inferior a uma banheira de resíduos. Conecte as seringas a cada entrada usando tubos PTFE e conectores de aço inoxidável de 18 calibres. Bombeie PBS com bomba três através da entrada da câmara inferior a 50 microliters por minuto, e com bomba dois através da entrada da câmara superior dois a 100 microliters por minuto.
Em seguida, carregue a seringa com o pré-gel de fibrinogênio, coloque-a imediatamente na bomba um e execute-a a 200 microliters por minuto. Uma vez que o pré-gel saia da saída da câmara superior, pare as bombas um e dois, em seguida, sem remover o tubo, deixe o chip para permitir a gelagem a 37 graus Celsius por 10 minutos. Após a gelagem, bloqueie a entrada da câmara superior com uma tampa, e bombeie o meio de cultura através da entrada da câmara superior dois com bomba três a 50 microliters por hora durante a noite.
24 horas após a geração do compartimento dérmico, verifique se as células do fibroblasto primário humano estão espalhadas no conjunto, em seguida, introduza cinco vezes 10 para os 6 HKCs por mililitro através da entrada do canal superior dois a 40 microliters por minuto por um minuto. Para fixação celular, coloque o chip durante a noite a 37 graus Celsius em uma incubadora saturada de umidade. Comece a bombear meio de cultura fresco com bomba três apenas através da entrada da câmara inferior a 50 microliters por minuto.
Na análise representativa, é exibida a altura do hidrogel ao longo da câmara superior da montagem. Uma altura média de 550 micrômetros foi ótima para o funcionamento do gel nas taxas de fluxo de 100 e 200 microliters por minuto para o PBS sacrificial e o pré-gel, respectivamente. A não descarga do PBS pelo canal inferior levou a discrepâncias entre a altura teórica do gel e a medida, com uma diferença de 40%Após 24 horas do início do protocolo de fluxo paralelo, os fibroblastos primários humanos foram encontrados para serem espalhados com sucesso no gel de fibrina na câmara superior da montagem, após o qual, os HKCs fluorescentes verdes expressos de proteína poderiam ser efetivamente semeados em cima do hidrogel.
A remoção da tubulação sem manter o sistema fechado durante a noite para permitir que o HKCS sedimente resultou em uma monocamada não uniforme e confluente de células. A análise confocal 3D do modelo de pele indiferenciado no chip microfluido mostrou claramente a superfície do hidrogel que separa os HKCs na parte superior do fibroblasto embutido na parte inferior. A pele gerada poderia ser exposta à interface ar/líquido para obter uma epiderme madura e diferenciada, e ainda ser caracterizada usando vários marcadores dérmicos e epidérmicos.
Esta técnica permite uma fabricação de dispositivos mais rápida e mais barata, e a geração de pele multicamadas usando microfluidos, proporcionando uma abordagem mais realista para testes de drogas e cosméticos.
