Bu, mikromakine, yapışkan vinil katmanları ve dermal bölme üretimi için paralel akış metodolojisi kullanarak çip üzerinde 3D cilt modellemek için yeni, litografi içermeyen bir protokoldür. Mikromakine vinil, pdms ve geleneksel litografi yaklaşımlarının bazı sınırlamalarını aşarak, cihazın düzeninde imalat sürecinde ve çok yönlülükte daha basitlik sağlar. Bu çok katmanlı çipli cilt, ilaç ve kozmetik test yaklaşımları için kullanılabilir, çünkü daha düşük maliyetlerle yüksek verimli taramaya izin verir ve birkaç hastalığı modellemek için kullanılabilir.
Brother Canvas Workspace yazılımını kullanarak bir mikroakışkan çip tasarlayarak başlayın. 30'a 30 santimetrelik bir çalışma alanı oluşturun ve bir svg dosyasında depolamadan önce çipin farklı katmanları için tasarım desenleriyle doldurun. 30'a 30 santimetre vinil levhaları kesin.
Düşük yapışkanlı bir paspasa yapıştırın ve gerektiğinde tüm hava kabarcıklarını ortadan kaldırın. Bir USB sürücü kullanarak, svg dosyasını kenar çiziciye yükleyin ve kesme parametrelerini sıfır seviyesinde kesme basıncı, üçüncü seviyede kesme bıçağı ve kesme hızı için birinci seviye olarak ayarlayın. Parametreler ayarlandığında, vinilli yapışkan paspası çiziciye yerleştirin ve kanal desenlerini 95 mikrometre kalınlığında vinil üzerinde kesme işlemine başlayın.
Uygun ayarlama kanalları, girişler ve çıkışlar için bir hizalayıcı kullanarak tüm cihazı birleştirin. Alt kanalı monte etmek için karşılık gelen bir mikro makine tasarımına sahip vinil katmanlar için yığın, hizalayıcıya yapışmayı önlemek için alt katmanın kapak bandını tutun. Polikarbonat gözenekli membranı, girişleri kapatmadan alt kanalın üzerine kesin ve yerleştirin.
Üst bölme tasarımına sahip 10 vinil katman ekleyin ve üzerine çift taraflı bantlı bir son katman yapıştırın. Cam kaydırağa yapıştırmak için çipi hizalayıcıdan çıkarın. Çift taraflı bant vinil tabakasının üzerine iki milimetre kalınlığında bir PDMS levha yerleştirin.
Çipin tamamen su geçirmez olduğundan emin olmak için, bir gecede çipin üzerine bir ağırlık bırakın. Ertesi gün, çipi beş dakika boyunca% 70 etanol ile yıkayarak sterilize edin, ardından damıtılmış suyla yıkayın. Pompa bir ve pompa iki üst hazne giriş bir ve üst hazne giriş iki, sırasıyla.
Pompa üç'ü alt hazne girişine bağlayın, ardından üst hazneyi ve alt hazne çıkışlarını bir atık küvetine bağlayın. PTFE tüpleri ve 18 kalibrelik paslanmaz çelik konektörler kullanarak şırınnaları her girişe bağlayın. PBS'yi pompala, üç pompa ile alt hazne girişinden dakikada 50 mikrolitre ve pompa iki üst hazne girişinden dakikada 100 mikrolitre.
Ardından, şırıngayı fibrinojen ön jel ile yükleyin, hemen bir pompaya yerleştirin ve dakikada 200 mikrolitrede çalıştırın. Ön jel üst hazne çıkışından çıktıktan sonra, bir ve iki pompayı durdurun, ardından boruyu çıkarmadan, 10 dakika boyunca jelleşmeyi 37 santigrat derecede izin vermek için çipi bırakın. Jelleşmeden sonra, üst hazne girişini bir kapakla tıkayın ve kültür ortamını üst oda girişinden ikiye pompala ve gece boyunca saatte 50 mikrolitre pompayla pompala.
Dermal bölmenin üretilmesinden 24 saat sonra, insan birincil fibroblast hücrelerinin montajda yayılarak yayılmadığını kontrol edin, ardından bir dakika boyunca dakikada 40 mikrolitrede iki üst kanal girişinden mililitre başına 6 HKC'ye beş kez 10 kez tanıtın. Hücre eki için, çipi neme doymuş bir inkübatöre 37 santigrat derecede gece boyunca yerleştirin. Dakikada 50 mikrolitrede sadece alt hazne girişinden üç pompa ile taze kültür ortamı pompalamaya başlayın.
Temsili analizde, montajın üst odası boyunca hidrojel yüksekliği görüntülenir. Ortalama 550 mikrometre yükseklik, kurban PBS ve ön jel için dakikada 100 ve 200 mikrolitre akış hızlarında jelin çalışması için optimumdu. PBS'nin alt kanaldan yıkanamaması, jelin teorik yüksekliği ile ölçülen arasında tutarsızlıklara yol açtı, paralel akış protokolünün başlatılmasından 24 saat sonra, insan birincil fibroblastlarının montajın üst odasındaki fibrin jelinde başarıyla yayıldığı tespit edildi, bunu takiben, yeşil floresan protein ifade eden HCC'ler hidrojel üzerine etkili bir şekilde tohumlanabilir.
HKCS'nin tortuya izin vermek için sistemi bir gecede kapalı tutmadan boruların çıkarılması, tekdüze olmayan, bir araya gelen bir hücre monolayerine neden oldu. Mikroakışkan çipteki farklılaşmamış cilt modelinin 3D konfokal analizi, üstteki HCC'leri altta gömülü fibroblasttan ayıran hidrojel yüzeyini açıkça gösterdi. Üretilen cilt, olgun ve farklılaştırılmış bir epidermis elde etmek için hava / sıvı arayüzüne maruz kalabilir ve ayrıca birkaç dermal ve epidermal belirteç kullanılarak karakterize edilebilir.
Bu teknik, daha hızlı ve daha ucuz bir cihaz imalatı ve mikroakışkanlar kullanılarak çok katmanlı cilt üretilmesini sağlayarak ilaçlar ve kozmetik testleri için daha gerçekçi bir yaklaşım sağlar.
