Dies ist ein neuartiges, lithographiefreies Protokoll zur Modellierung eines 3D-Skin-on-Chips unter Verwendung von mikrobearbeiteten, adhäsiven Vinylschichten und einer Parallelflussmethodik für die Erzeugung von Hautkompartimenten. Mikrobearbeitetes Vinyl bietet mehr Einfachheit im Herstellungsprozess und Vielseitigkeit im Layout des Geräts und überwindet einige der Einschränkungen von PDMS und traditionellen Lithographieansätzen. Dieser mehrschichtige Skin-on-a-Chip kann für medikamentöse und kosmetische Testansätze verwendet werden, da er ein Hochdurchsatz-Screening zu geringeren Kosten ermöglicht und zur Modellierung mehrerer Krankheiten verwendet werden könnte.
Beginnen Sie mit dem Entwerfen eines mikrofluidischen Chips mit der Brother Canvas Workspace-Software. Erstellen Sie einen 30 x 30 Zentimeter großen Arbeitsbereich und füllen Sie ihn mit den Entwurfsmustern für die verschiedenen Schichten des Chips, bevor Sie ihn in einer svg-Datei speichern. Schneiden Sie die 30 x 30 Zentimeter großen Vinylplatten.
Kleben Sie es auf eine Klebematte mit geringer Klebrigkeit und beseitigen Sie bei Bedarf alle Luftblasen. Laden Sie die svg-Datei mit einem USB-Laufwerk auf den Kantenplotter hoch und legen Sie die Schnittparameter als Schnittdruck auf Stufe Null, Schneidklinge auf Stufe drei und Stufe eins für die Schnittgeschwindigkeit fest. Wenn die Parameter eingestellt sind, legen Sie die Klebematte mit dem Vinyl in den Plotter und beginnen Sie mit dem Schneiden der Kanalmuster auf 95 Mikrometer dickem Vinyl.
Stellen Sie das gesamte Gerät zusammen, indem Sie einen Aligner für die richtigen Einstellkanäle, Ein- und Auslässe verwenden. Stapeln Sie sich für Vinylschichten mit einem entsprechenden Mikromaschinendesign für die Montage des unteren Kanals, wobei Sie das Abdeckband der unteren Schicht beibehalten, um ein Verkleben am Aligner zu vermeiden. Schneiden Sie die poröse Polycarbonatmembran aus und legen Sie sie auf den unteren Kanal, ohne die Einlässe zu bedecken.
Fügen Sie 10 Vinylschichten mit dem oberen Kammerdesign hinzu und kleben Sie eine doppelseitige Klebeband-Endschicht darauf. Entfernen Sie den Chip vom Aligner, um ihn auf den Glasobjektträger zu kleben. Legen Sie ein zwei Millimeter dickes PDMS-Blatt auf die doppelseitige Bandvinylschicht.
Um sicherzustellen, dass der Chip vollständig wasserdicht ist, lassen Sie über Nacht ein Gewicht auf dem Chip. Am nächsten Tag sterilisieren Sie den Chip, indem Sie ihn fünf Minuten lang mit 70% Ethanol spülen, gefolgt von einer Wäsche mit destilliertem Wasser. Schließen Sie Pumpe eins und Pumpe zwei an den oberen Kammereinlass eins bzw. den oberen Kammereinlass zwei an.
Verbinden Sie die Pumpe drei mit dem unteren Kammereinlass und verbinden Sie dann die auslässt der oberen Kammer und der unteren Kammer mit einer Abfallwanne. Verbinden Sie die Spritzen mit PTFE-Rohren und 18-Gauge-Edelstahlverbindern mit jedem Einlass. Pumpe PBS mit Pumpe drei durch den unteren Kammereinlass mit 50 Mikrolitern pro Minute und mit Pumpe zwei durch den oberen Kammereinlass zwei mit 100 Mikroliter pro Minute.
Laden Sie dann die Spritze mit dem Fibrinogen-Vorgel, legen Sie sie sofort in Pumpe eins und lassen Sie sie mit 200 Mikrolitern pro Minute laufen. Sobald das Pre-Gel den Auslass der oberen Kammer verlässt, stoppen Sie die Pumpen eins und zwei, dann, ohne den Schlauch zu entfernen, lassen Sie den Chip, um die Gelierung bei 37 Grad Celsius für 10 Minuten zu ermöglichen. Blockieren Sie nach der Gelierung den ersten Einlass der oberen Kammer mit einer Kappe und pumpen Sie das Kulturmedium durch den zweiten Einlass der oberen Kammer mit Pumpe drei bei 50 Mikroliter pro Stunde über Nacht.
Überprüfen Sie 24 Stunden nach der Erzeugung des Hautkompartiments, ob menschliche primäre Fibroblastenzellen in der Baugruppe verteilt sind, und geben Sie dann fünfmal 10 zu den 6 HKCs pro Milliliter durch den oberen Kanaleinlass zwei bei 40 Mikroliter pro Minute für eine Minute. Zur Zellbefestigung stellen Sie den Chip über Nacht bei 37 Grad Celsius in einen feuchtigkeitsgesättigten Inkubator. Beginnen Sie mit dem Pumpen von Frischekulturmedium mit Pumpe drei nur durch den unteren Kammereinlass mit 50 Mikrolitern pro Minute.
In der repräsentativen Analyse wird die Höhe des Hydrogels entlang der oberen Kammer der Baugruppe angezeigt. Eine durchschnittliche Höhe von 550 Mikrometern war optimal für die Funktion des Gels bei den Durchflussraten von 100 bzw. 200 Mikrolitern pro Minute für das Opfer-PBS bzw. das Pre-Gel. Das Versäumnis, PBS durch den unteren Kanal zu spülen, führte zu Diskrepanzen zwischen der theoretischen Höhe des Gels und der gemessenen Höhe mit einem Unterschied von 40% Nach 24 Stunden nach Beginn des Parallelflussprotokolls wurde festgestellt, dass die menschlichen primären Fibroblasten erfolgreich im Fibringel in der oberen Kammer der Baugruppe verteilt wurden. Danach könnten grün fluoreszierende proteinexprimierende HKCs effektiv auf das Hydrogel gesät werden.
Das Entfernen von Schläuchen, ohne das System über Nacht geschlossen zu halten, damit das HKCS sedimentieren konnte, führte zu einer ungleichmäßigen, konfluierenden Monoschicht von Zellen. Die konfokale 3D-Analyse des undifferenzierten Hautmodells im mikrofluidischen Chip zeigte deutlich die Oberfläche des Hydrogels, das HKCs oben von dem unten eingebetteten Fibroblasten trennt. Die erzeugte Haut könnte der Luft/Flüssigkeits-Grenzfläche ausgesetzt werden, um eine reife und differenzierte Epidermis zu erhalten, und weiter unter Verwendung mehrerer dermaler und epidermaler Marker charakterisiert werden.
Diese Technik ermöglicht eine schnellere und kostengünstigere Geräteherstellung und die Erzeugung von mehrschichtiger Haut mit Hilfe der Mikrofluidik, was einen realistischeren Ansatz für Arzneimittel- und Kosmetiktests bietet.
