用于硝酸盐和亚硝酸盐测量的大鼠骨骼肌匀浆的制备

骨骼肌是硝酸盐的主要储存库，在转化为亚硝酸盐后，在运动过程中作为NO的来源。在这里，我们提出了测量肌肉和其他组织中这些离子的方法。首先，通过在蒸馏水中混合890毫摩尔铁氰化钾和118毫摩尔N-甲基马来酰亚胺来制备硝酸盐保存或终止溶液，确保溶液中没有晶体残留，然后以1：9的比例加入非离子表面活性剂并轻轻混合以避免起泡。

用蒸馏水以1：9的比例稀释终止溶液，并将稀释的终止溶液加入均质管中。接下来，在冰上解冻先前分离和冷冻的大鼠肌肉组织。一旦组织解冻，从骨骼肌中去除剩余的脂肪和结缔组织。

切下骨骼肌的碎片，在纱布上吸干。称出适量的骨骼肌组织，然后将预配重组织放入含有终止溶液的匀浆管中。为了在旋转均质机中进行均质化，将装有预先称重的骨骼肌和预先测量的停止溶液的 M 型管放入机器中。

将每个样品均质两次，每次均质后，立即将试管放在冰上5分钟冷却。均质化后，短暂离心管。将试管放回冰上，在涡旋15秒之前加入适当体积的甲醇。

再次均质化样品并在冰上孵育30分钟，然后离心样品，吸出上清液，继续测量亚硝酸盐和硝酸盐水平。对于磁珠均质化，将骨骼肌组织放入含珠子的管中，并以仪器上可用的最高速度匀浆两次，持续 45 秒。每次均质后，立即将试管置于冰上5分钟冷却，然后离心试管，将试管放回冰上，并在涡旋15秒前加入适量的甲醇。

再次均质化样品45秒，然后在冰上孵育30分钟。离心样品，吸出上清液，然后继续测量亚硝酸盐和硝酸盐水平。对于基于粉碎机的均质化，准备含有稀释终止溶液的试管，然后称重并记录试管的重量。

粉碎机工具在干冰上冷却30分钟后，使用在液氮中冷却的镊子，将预先称重的组织样品转移到粉碎机中，然后加入少量液氮以确保组织处于液氮温度。95%的液氮汽化后，将破碎工具放在组织顶部并用力按压以感受样品破碎，然后用木槌敲击破碎工具3至5次。当整个样品粉碎后，使用液氮冷却的勺子和镊子，将粉碎的组织直接转移到含有稀释终止溶液的预称重管中。

接下来，涡旋管子 15 秒，然后打开管子以检查是否有任何组织卡在盖子里。如果有，请尝试将其移开，然后再次涡旋。将样品短暂离心 2 至 3 秒。

再次称量试管并通过从该新重量中减去原始管重量来计算组织重量。将试管放在冰上。向管中加入适量的甲醇，彻底涡旋管15秒，然后在冰上孵育30分钟，然后离心样品，吸出上清液，继续测量亚硝酸盐和硝酸盐水平。

使用旋转均质机、珠均质机和粉碎机制备的大鼠骨骼肌匀浆的硝酸盐水平和大鼠骨骼肌匀浆相似。有趣的是，对于亚硝酸盐水平，粉碎机制备的均质样品显示出最高值，该值与其他两个样品值在统计学上不同。使用微球均质器从20、50和200毫克组织制备的臀肌匀浆中亚硝酸盐和硝酸盐水平的比较表明，肌肉样本大小之间的硝酸盐和亚硝酸盐水平均无显着差异。

比较不同啮齿动物腿部骨骼肌组织中的硝酸盐水平显示，臀肌的硝酸盐水平比其他三种肌肉组织高约两倍。然而，这些差异没有达到统计学意义。与硝酸盐水平相似，臀肌中的硝酸盐浓度也高于其他3种肌肉组织，并且明显高于腓肠肌样本。

我们的方法相对简单，非常适合小样品，同时在样品制备过程中保留硝酸盐和亚硝酸盐。