Скелетные мышцы служат основным резервуаром нитрата, который после его преобразования в нитрит служит источником NO во время физических упражнений. Здесь мы представляем методологию измерения этих ионов в мышечных и других тканях. Для начала приготовьте раствор для сохранения нитратов или остановки, объединив 890 миллимоляров феррицианида калия и 118 миллимоляров n-метилмалеймида в дистиллированной воде, гарантируя, что в растворе не останется кристаллов, затем добавьте неионное поверхностно-активное вещество в соотношении 1 к 9 и аккуратно перемешайте, чтобы избежать вспенивания.
Разбавить стоп-раствор в соотношении 1 к 9 дистиллированной водой и добавить разбавленный стоп-раствор в гомогенизационную трубку. Затем разморозьте предыдущую изолированную и замороженную мышечную ткань крысы на льду. Как только ткань разморозится, удалите оставшийся жир и соединительную ткань из скелетной мышцы.
Отрежьте кусочки скелетной мышцы и промойте их на марле для высыхания. Взвесьте соответствующее количество скелетной мышечной ткани, затем поместите предварительно весовую ткань в гомогенизационные трубки, содержащие стоп-раствор. Для гомогенизации во вращающемся гомогенизаторе поместите в машину трубку типа М, содержащую предварительно взвешенную скелетную мышцу и предварительно измеренный стоп-раствор.
Гомогенизируйте каждый образец дважды, и после каждой гомогенизации поместите трубку на лед сразу на 5 минут, чтобы остыть. После гомогенизации центрифугируют трубку ненадолго. Поместите трубку обратно на лед и добавьте соответствующий объем метанола перед вихрем в течение 15 секунд.
Снова гомогенизируйте образец и инкубируйте его на льду в течение 30 минут, затем центрифугируйте образец, аспирируйте супернатант и приступайте к измерению уровней нитритов и нитратов. Для гомогенизации шариков поместите скелетную мышечную ткань в шарикодержащую трубку и гомогенизируйте дважды в течение 45 секунд с максимальной скоростью, доступной на инструменте. После каждой гомогенизации немедленно поместите трубку на лед на 5 минут, чтобы остыть, затем центрифугируйте трубку, поместите трубку обратно на лед и добавьте соответствующий объем метанола перед вихрем в течение 15 секунд.
Гомогенизируйте образец еще раз в течение 45 секунд, затем высиживайте его на льду в течение 30 минут. Центрифугируйте образец, аспирируйте надосадочный агент и приступайте к измерению уровней нитритов и нитратов. Для гомогенизации на основе пульверизатора подготовьте пробирки, содержащие разбавленный стоп-раствор, затем взвесьте и запишите вес трубок.
После охлаждения инструмента измельчителя на сухом льду в течение 30 минут, используя пинцет, охлажденный жидким азотом, перенесите предварительно взвешенный образец ткани в пульверизатор, затем добавьте небольшое количество жидкого азота, чтобы убедиться, что ткань находится при температуре жидкого азота. После того, как 95% жидкого азота испарится, поместите дробильный инструмент поверх ткани и плотно прижмите, чтобы почувствовать, как образец раздавливается, затем, используя молоток, ударьте дробильным инструментом от 3 до 5 раз. Когда весь образец будет измельчен, используя ложку с жидким азотным охлаждением и пинцет, непосредственно переместите измельченную ткань в предварительно взвешенную трубку, содержащую разбавленный стоп-раствор.
Затем вращайте трубку в течение 15 секунд, затем откройте трубку, чтобы проверить наличие ткани, застрявшей в крышке. Если есть, попробуйте выбить его, затем снова вихрь. Кратковременно центрифугируйте образец в течение 2-3 секунд.
Снова взвесьте трубку и рассчитайте вес ткани, вычитая исходный вес трубки из этого нового веса. Поместите трубку на лед. Добавьте соответствующий объем метанола в трубку и тщательно вращайте трубку в течение 15 секунд, прежде чем инкубировать ее на льду в течение 30 минут, затем центрифугируйте образец, аспирируйте супернатант и приступайте к измерению уровней нитритов и нитратов.
Уровни нитратов и гомогенаты скелетных мышц крыс, приготовленные с использованием ротационного гомогенизатора, гомогенизатора бусин и пульверизатора, были сходны. Интересно, что для уровней нитритов гомогенатный образец, подготовленный измельчителем, показал наибольшее значение, которое статистически отличалось от двух других значений выборки. Сравнение уровней нитритов и нитратов в гомогенатах ягодичной мышцы, полученных из 20, 50 и 200 миллиграммов ткани с использованием гомогенизатора бусин, показало, что ни уровни нитрата, ни нитрита существенно не отличались между размерами мышечной выборки.
Сравнение уровней нитратов в различных скелетных мышечных тканях ног грызунов показало, что ягодичная мышца имела примерно в два раза более высокие уровни нитратов, чем три другие мышечные ткани. Однако эти различия не достигли статистической значимости. Подобно уровням нитратов, концентрация нитратов в ягодичной мышце также была выше, чем в трех других мышечных тканях, и была значительно выше, чем в образце икроножной мышцы.
Наш метод относительно прост и хорошо подходит для небольших образцов при сохранении нитратов и нитритов во время пробоподготовки.
