تعمل العضلات الهيكلية كخزان رئيسي للنترات التي ، بعد تحويلها إلى النتريت ، تعمل كمصدر ل NO أثناء التمرين. نقدم هنا منهجية لقياس هذه الأيونات في العضلات والأنسجة الأخرى. للبدء ، قم بإعداد محلول حفظ النترات أو إيقافه عن طريق الجمع بين 890 مليمولار من فيريسيانيد البوتاسيوم و 118 مليمولار n-methylmaleimide في الماء المقطر ، مما يضمن عدم بقاء بلورات في المحلول ، ثم أضف خافض للتوتر السطحي غير الأيوني بنسبة 1 إلى 9 واخلطه برفق لتجنب الرغوة.
قم بتخفيف محلول التوقف بنسبة 1 إلى 9 بالماء المقطر وأضف محلول التوقف المخفف إلى أنبوب التجانس. بعد ذلك ، قم بإذابة الأنسجة العضلية السابقة المعزولة والمجمدة على الجليد. بمجرد ذوبان الأنسجة ، قم بإزالة الدهون المتبقية والنسيج الضام من العضلات الهيكلية.
قطع قطع من العضلات والهيكل العظمي وصمة عار عليها على الشاش حتى تجف. قم بوزن الكمية المناسبة من الأنسجة العضلية الهيكلية ، ثم ضع نسيج الوزن المسبق في أنابيب التجانس التي تحتوي على محلول التوقف. للتجانس في الخالط الدوار ، ضع الأنبوب من النوع M الذي يحتوي على العضلات الهيكلية الموزونة مسبقا ومحلول التوقف المقاس مسبقا في الماكينة.
قم بتجانس كل عينة مرتين ، وبعد كل تجانس ، ضع الأنبوب على الثلج على الفور لمدة 5 دقائق ليبرد. بعد التجانس ، الطرد المركزي الأنبوب لفترة وجيزة. ضع الأنبوب مرة أخرى على الثلج وأضف الحجم المناسب من الميثانول قبل الدوامة لمدة 15 ثانية.
تجانس العينة مرة أخرى واحتضانها على الثلج لمدة 30 دقيقة ، ثم طرد العينة بالطرد المركزي ، واستنشاق المادة الطافية ، والمضي قدما في قياس مستويات النتريت والنترات. لتجانس الخرز ، ضع النسيج العضلي الهيكلي في أنبوب يحتوي على حبة وتجانس مرتين لمدة 45 ثانية بأعلى سرعة متاحة على الجهاز. بعد كل تجانس ، ضع الأنبوب على الفور على الثلج لمدة 5 دقائق ليبرد ، ثم طرد الأنبوب بالطرد المركزي ، ضع الأنبوب مرة أخرى على الجليد ، وأضف الحجم المناسب من الميثانول قبل الدوامة لمدة 15 ثانية.
قم بتجانس العينة مرة أخرى لمدة 45 ثانية ثم احتضانها على الثلج لمدة 30 دقيقة. قم بالطرد المركزي للعينة ، واستنشاق المادة الطافية ، وانتقل إلى قياس مستويات النتريت والنترات. من أجل التجانس القائم على الطاحن ، قم بإعداد الأنابيب التي تحتوي على محلول التوقف المخفف ، ثم قم بوزن وتسجيل وزن الأنابيب.
بعد تبريد أداة الطاحن على الثلج الجاف لمدة 30 دقيقة ، باستخدام ملاقط مبردة في النيتروجين السائل ، انقل عينة الأنسجة التي تم وزنها مسبقا إلى الطاحن ، ثم أضف كمية صغيرة من النيتروجين السائل للتأكد من أن الأنسجة في درجة حرارة النيتروجين السائل. بعد تبخير 95٪ من النيتروجين السائل ، ضع أداة التكسير فوق الأنسجة واضغط بقوة لتشعر بسحق العينة ، ثم باستخدام مطرقة ، اضرب أداة التكسير من 3 إلى 5 مرات. عندما يتم سحق العينة بأكملها ، باستخدام ملعقة وملاقط مبردة بالنيتروجين السائل ، قم بنقل الأنسجة المسحوقة مباشرة إلى الأنبوب الذي تم وزنه مسبقا والذي يحتوي على محلول التوقف المخفف.
بعد ذلك ، قم بتدوير الأنبوب لمدة 15 ثانية ، ثم افتح الأنبوب للتحقق من وجود أي نسيج عالق في الغطاء. إذا كان هناك ، حاول إزاحته ، ثم دوامة مرة أخرى. الطرد المركزي لفترة وجيزة العينة لمدة 2 إلى 3 ثوان.
قم بوزن الأنبوب مرة أخرى واحسب وزن الأنسجة عن طريق خصم وزن الأنبوب الأصلي من هذا الوزن الجديد. ضع الأنبوب على الثلج. أضف كمية مناسبة من الميثانول إلى الأنبوب وقم بتدوير الأنبوب جيدا لمدة 15 ثانية قبل احتضانه على الثلج لمدة 30 دقيقة ، ثم قم بالطرد المركزي للعينة ، وشفط المادة الطافية ، وانتقل إلى قياس مستويات النتريت والنترات.
كانت مستويات النترات وتجانس عضلات الهيكل العظمي للفئران المحضرة باستخدام الخالط الدوار والخالط الخرز والسحق متشابهة. ومن المثير للاهتمام ، بالنسبة لمستويات النتريت ، أظهرت عينة التجانس التي أعدها الطاحن أعلى قيمة ، والتي كانت مختلفة إحصائيا عن قيمتي العينة الأخريين. أظهرت مقارنة مستويات النتريت والنترات في تجانس الألوية المحضرة من 20 و 50 و 200 ملليغرام من الأنسجة باستخدام خالط حبة أنه لا توجد مستويات نترات ولا نتريت تختلف اختلافا كبيرا بين أحجام عينات العضلات.
كشفت مقارنة مستويات النترات في أنسجة العضلات الهيكلية المختلفة لساق القوارض أن عضلة الألوية لديها مستويات نترات أعلى بمرتين تقريبا من الأنسجة العضلية الثلاثة الأخرى. ومع ذلك ، لم تصل هذه الاختلافات إلى دلالة إحصائية. على غرار مستويات النترات ، كان تركيز النترات في عضلة الألوية أعلى أيضا من ذلك الموجود في الأنسجة العضلية الثلاثة الأخرى وكان أعلى بكثير من ذلك الموجود في عينة gastrocnemius.
طريقتنا بسيطة نسبيا ومناسبة تماما للعينات الصغيرة مع الحفاظ على النترات والنتريت أثناء تحضير العينة.
