Этот протокол измеряет конкурентоспособность самцов комаров, что является необходимым условием для программ подавления популяции комаров на основе высвобождения самцов. Этот критерий пригодности оценивается как часть контроля качества и оценки деформации. Этот метод сокращает время эксперимента на 90% и позволяет проводить прямое сравнение конкурентоспособности спаривания между двумя стерильными или зараженными Вольбахией линиями.
Выполнять эту процедуру будут Ирен Ли и Кенг Вай Мак. Для начала половые самцы и самки комаров на стадии куколки, в соответствии с их различиями в размерах. Для каждого набора комаров перенесите 100 детенышей самцов в предварительно маркированную клетку для кормления сахарозой или кормления сахарозой родамина B.
Поместите куколок самок небольшими партиями по 40-50 штук в клетку. При появлении имагоса проверьте клетки на наличие самцов комаров. Для приготовления 0,2% раствора сахарозы родамина В растворяют 200 миллиграммов порошка родамина В на каждые 100 миллилитров 10%-ного раствора сахарозы.
Хорошо перемешайте, чтобы весь порошок растворился. Приготовьте 20 бутылочек для кормления сахаром с фитилем. Добавьте 10 миллилитров 10% сахарозы в 10 бутылочек для кормления и 10 миллилитров 0,2% раствора сахарозы родамина В для других 10 бутылок для кормления.
Поместите пять бутылочек-кормушек в каждую подготовленную мужскую клетку и дайте самкам комаров кормиться в течение трех дней до брачного эксперимента. Включите ртутную лампу горелки и стереомикроскоп. Дайте источнику света ртутной горелки стабилизироваться в течение 10 минут.
Затем устанавливают флуоресцентные фильтры для красного флуоресцентного белка один. Аспирировать небольшое количество комаров за раз в стеклянную трубку перорального аспиратора. Через стеклянную трубку наблюдайте за телом самцов комаров под флуоресцентным стереомикроскопом.
Используйте для эксперимента только самцов комаров, отмеченных родамином B. Перенос набора самцов комаров в 12 бумажных стаканчиков, закрепленных сеткой. Поместите 10 самцов сахарозы на чашку в шесть чашек, а 10 самцов сахарозы, которых кормили самцов комаров на чашку, в остальные шесть чашек.
Повторите этот шаг для самцов комаров B. Установите 12 клеток для брачного анализа. В каждую из шести клеток входят 10 самцов комаров A, которые имеют маркировку Rhodamine B, 10 немаркированных самцов комаров B и 10 девственных комаров дикого типа.
В остальные шесть клеток входят 10 немаркированных самцов комаров A, 10 самцов комаров с маркировкой Rhodamine B и 10 девственных комаров дикого типа. Маркировка этих клеток, чтобы четко различать две брачные комбинации. Поместите соответствующие чашки самцов в клетки для спаривания в соответствии с этикетками.
Снимите сетку и осторожно постучите по чашке, чтобы вытолкнуть самцов из чашки. Осторожно извлеките бумажный стаканчик и сетку из клетки, чтобы комары не вырвались из клетки. Позвольте самцу комаров акклиматизироваться в брачной клетке не менее часа.
Используя пероральный аспиратор, переведите девственных комаров дикого типа в 12 бумажных стаканчиков, каждая чашка содержит 10 комаров. После периода акклиматизации самцов комаров перенесите одну чашку самок в каждую брачный клетку и снимите сетку. Осторожно вставьте чашку, чтобы поощрить оставшихся самок комаров из чашки, затем осторожно извлеките бумажный стаканчик и сетку из клетки, чтобы комары не вырвались из клетки.
Дайте спариваться в течение трех часов, а затем завершите брачный эксперимент, удалив всех комаров из каждой клетки с помощью механического аспиратора. Холодно обезболивайте комаров на льду не менее пяти минут. Когда комары будут полностью обезболены, осторожно подберите самок комаров и разместили их в отдельном бумажном стаканчике, закрепленном сеткой.
Нанесите на бумажный стаканчик соответствующую этикетку из клетки для спаривания на чашку. Чтобы забить женские сперматозоиды, обезболивайте самок комаров на льду не менее пяти минут перед рассечением под стереомикроскопом. Рассекте самку комара под стереомикроскопом.
Исследуйте сперматеки под микроскопом. Если самка не оплодотворена, все три сперматеки будут пустыми, а при оплодотворений две или три сперматеки будут заполнены подвижными сперматозоидами. Для осемененных лиц определите, содержат ли сперматеки семенную жидкость с маркировкой родамин B, исследуя их под флуоресцентным стереомикроскопом, оснащенным фильтром RFP1.
Если сперматеки заполнены семенной жидкостью, которая не отмечена родамином В, флуоресценции не наблюдается. С другой стороны, если сперматека содержит семенную жидкость с маркировкой Родамин В, она будет флуоресцирована оранжевым цветом. Цель этого анализа конкурентоспособности спаривания состояла в том, чтобы определить, может ли быть потеря мужской брачной пригодности после нескольких поколений инбридинга.
Проведены экспериментальные трипликаты анализа конкурентоспособности спаривания, здесь показаны данные оплодотведения. Самки дикого типа были оплодотвлены либо инбредными, либо ауткроссеными самцами с взаимной маркировкой. Результаты показывают, что доля самок, оплодотновенных инбредными или скрещивающимися самцами, не была затронута маркировкой родамина B.
Значительно более высокий процент самок спаривался с самцами ауткросса, чем с инбредными самцами у всех трех репликантов, что указывает на то, что инбридинг может привести к потере брачной пригодности. Важно подготовить дополнительные клетки для самок комаров. Не используйте самок комаров из клетки, которая была загрязнена самцами комаров, так как предварительно оплодотворенные самки сделают все данные недействительными.
Помимо лабораторного анализа конкурентоспособности спаривания, эта процедура может быть использована в экспериментах по высвобождению-повторному захвату меток для изучения биологии спаривания насекомых, динамики популяции и ее рассеивания.
