Este protocolo mede a competitividade do acasalamento de mosquitos machos, que é um pré-requisito para programas de supressão populacional de mosquitos baseados em liberação masculina. Este critério de aptidão é avaliado como parte do controle de qualidade e avaliação da tensão. Este método reduz o tempo experimental em 90% e permite a comparação direta da competitividade do acasalamento entre duas linhas estéreis ou infectadas por Wolbachia.
A realização deste procedimento será Irene Li e Keng Wai Mak. Para começar, sexo os mosquitos machos e fêmeas na fase pupal, de acordo com suas diferenças de tamanho. Para cada conjunto de mosquitos, transfira 100 pupas machos para uma gaiola pré-rotulada para alimentação de sacarose ou alimentação de sacarose Rhodamine B.
Coloque a pupa fêmea em pequenos lotes de 40 a 50 por gaiola. Após o surgimento dos imagos, verifique as gaiolas para a presença de mosquitos machos. Para preparar a solução de sacarose Rhodamine B de 0,2%, dissolva 200 miligramas de pó de Rhodamina B para cada 100 mililitros de solução de 10% de sacarose.
Misture bem para garantir que todo o pó seja dissolvido. Prepare 20 garrafas de alimentador de açúcar com um pavio. Adicione 10 mililitros de 10% de sacarose a 10 garrafas alimentadores e 10 mililitros de solução de sacarose Rhodamine B de 0,2% para as outras 10 garrafas alimentadores.
Coloque cinco garrafas alimentados em cada gaiola masculina preparada e permita que os mosquitos machos se alimentem por três dias antes do experimento de acasalamento. Ligue a lâmpada do queimador de mercúrio e o microscópio estéreo. Deixe a fonte de luz para a lâmpada queimador de mercúrio estabilizar por 10 minutos.
Em seguida, coloque os filtros de fluorescência para proteína de fluorescência vermelha um. Aspire um pequeno número de mosquitos de cada vez no tubo de vidro do aspirador oral. Através do tubo de vidro, observe o corpo dos mosquitos machos sob o microscópio estéreo fluorescente.
Use apenas mosquitos machos marcados com Rhodamine B para o experimento. Transfere um mosquito macho em 12 copos de papel protegidos com redes. Coloque 10 mosquitos machos alimentados por xícara em seis xícaras, e 10 sacarose Rhodamine B alimentada mosquitos machos por xícara nas outras seis xícaras.
Repita este passo para os mosquitos machos conjuntos B. Coloque 12 gaiolas para o ensaio de acasalamento. Em cada uma das seis gaiolas, incluem 10 conjuntos De mosquitos machos que são marcados por Rhodamine B, 10 mosquitos machos não marcados e 10 mosquitos fêmeas fêmeas virgens.
Nas outras seis gaiolas, incluem 10 mosquitos machos não marcados, 10 mosquitos machos marcados por Rhodamine B e 10 mosquitos fêmeas fêmeas selvagens virgens. Rotule essas gaiolas para distinguir claramente entre as duas combinações de acasalamento. Coloque as respectivas xícaras de machos nas gaiolas de acasalamento de acordo com os rótulos.
Retire a rede e bata suavemente no copo para tirar os machos da xícara. Remova cuidadosamente o copo de papel e a rede da gaiola para garantir que nenhum mosquito escape da gaiola. Permita que os mosquitos machos se aclimatar na gaiola de acasalamento por pelo menos uma hora.
Usando um aspirador oral, transfira mosquitos fêmeas fêmeas virgens em 12 xícaras de papel, cada xícara contendo 10 mosquitos. Após o período de aclimatação para os mosquitos machos, transfira uma xícara de fêmeas para cada gaiola de acasalamento e remova a rede. Empurre suavemente o copo para encorajar qualquer mosquito fêmea restante para fora do copo, em seguida, remova cuidadosamente o copo de papel e a rede da gaiola para garantir que nenhum mosquito escape da gaiola.
Permita que o acasalamento ocorra por três horas e, em seguida, termine o experimento de acasalamento removendo todos os mosquitos de cada gaiola com um aspirador mecânico. Anesthetize os mosquitos no gelo por pelo menos cinco minutos. Quando os mosquitos estiverem totalmente anestesiados, pegue delicadamente os mosquitos fêmeas e abriga-os em um copo de papel separado protegido com rede.
Rotule o copo de papel transferindo o respectivo rótulo da gaiola de acasalamento para o copo. Para pontuar a espermatozoide fêmea, anestesiar o mosquito fêmea no gelo por pelo menos cinco minutos antes da dissecação sob um microscópio estéreo. Dissecar o mosquito fêmea sob o microscópio estéreo.
Examine a espermatozoide sob microscópio. Se a fêmea não for inseminada, todas as três espermatozoides estariam vazias, e se inseminadas, duas ou três das espermatozoides estariam cheias de espermatozoides. Para indivíduos inseminados, determine se a pasta de esperma contém rhodamine B fluido seminal marcado examinando-os sob o microscópio estéreo fluorescente equipado com um filtro RFP1.
Se a pasta é preenchida com fluido seminal que não está marcado com Rhodamina B, nenhuma fluorescência é observada. Por outro lado, se a espermatozoide contém rhodamina B marcado fluido seminal, ele fluoresceria laranja. O objetivo deste ensaio de competitividade de acasalamento foi determinar se poderia haver uma perda na aptidão do acasalamento masculino após várias gerações de endogamia.
Triplicados experimentais do ensaio de competitividade de acasalamento foram realizados, e os dados de inseminação são mostrados aqui. As fêmeas selvagens foram inseminadas pelos machos de raça ou de fora, com marcação recíproca. Os resultados mostram que a proporção de fêmeas inseminadas pelos machos de raça ou outcross não foi afetada pela marca rhodamina B.
Uma porcentagem significativamente maior de fêmeas acasaladas com os machos de fora do que com os machos de raça nos três replicantes, indicando que a endogamia poderia levar à perda no acasalamento. É importante preparar gaiolas extras de mosquitos fêmeas. Não utilize mosquitos fêmeas de uma gaiola contaminada por mosquitos machos, pois fêmeas pré-inseminadas tornariam todos os dados inválidos.
Além do ensaio de competitividade de acasalamento baseado em laboratório, este procedimento pode ser usado em experimentos de liberação de marcas para estudar biologia de acasalamento de insetos, dinâmica populacional e sua dispersão.
