Bu protokol, erkek salınımlı sivrisinek popülasyonu bastırma programları için bir ön koşul olan erkek sivrisinek çiftleşme rekabet gücünü ölçer. Bu fitness kriteri kalite kontrol ve gerinim değerlendirmesinin bir parçası olarak değerlendirilir. Bu yöntem deneysel süreyi% 90 azaltır ve iki steril veya Wolbachia enfekte hat arasında çiftleşme rekabet gücünün doğrudan karşılaştırılmasına izin verir.
Bu işlemi Irene Li ve Keng Wai Mak yapacaktır. Başlamak için, erkek ve dişi sivrisinekleri boyut farklılıklarına göre pupal aşamasında cinsiyete bağlayın. Her sivrisinek seti için, 100 erkek pupayı sakkaroz besleme veya Rhodamine B sakkaroz besleme için önceden etiketlenmiş bir kafese aktarın.
Dişi pupaları kafes başına 40 ila 50 arasında küçük gruplar halinde yerleştirin. Imagos'un ortaya çıkmasından sonra, kafesleri erkek sivrisineklerin varlığı için kontrol edin. % 0.2 Rhodamine B sakkaroz çözeltisini hazırlamak için, her 100 mililitre% 10 sakkaroz çözeltisi için 200 miligram Rhodamine B tozunun çözün.
Tüm tozun çözüldüğüne emin olmak için iyice karıştırın. Fitil ile 20 şeker besleyici şişe hazırlayın. 10 besleyici şişeye 10 mililitre% 10 sakkaroz ve diğer 10 besleyici şişe için 10 mililitre% 0.2 Rhodamine B sakkaroz çözeltisi ekleyin.
Hazırlanan her erkek kafesine beş besleyici şişe yerleştirin ve erkek sivrisineklerin çiftleşme deneyinden önce üç gün boyunca beslenmesine izin verin. Cıva yakıcı lambayı ve stereo mikroskobu açın. Cıva brülörü lambasına giden ışık kaynağının 10 dakika boyunca stabilize olmasını bekleyin.
Daha sonra kırmızı floresan proteini bir için floresan filtrelerini ayarlayın. Oral aspiratör cam tüpüne bir seferde az sayıda sivrisinek aspire edin. Cam tüpten, floresan stereo mikroskop altında erkek sivrisineklerin vücudunu gözlemleyin.
Deney için sadece Rhodamine B ile işaretlenmiş erkek sivrisinekleri kullanın. Transfer seti Ağ ile sabitlenerek 12 kağıt bardak içine bir erkek sivrisinek. Bardak başına 10 sakkarozla beslenen erkek sivrisinekleri altı bardağa yerleştirin ve diğer altı bardağa fincan başına 10 Rhodamine B sakkaroz beslendi.
B kümesi erkek sivrisinekler için bu adımı tekrarlayın. Çiftleşme tahlilleri için 12 kafes kurun. Altı kafesin her birinde, Rhodamine B işaretli 10 set A erkek sivrisinek, 10 işaretsiz B kümesi erkek sivrisinek ve 10 bakir vahşi tip dişi sivrisinek bulunur.
Diğer altı kafeste, 10 işaretsiz set A erkek sivrisinek, 10 Rhodamine B işaretli B seti erkek sivrisinek ve 10 bakir vahşi tip dişi sivrisinek bulunur. İki çiftleşme kombinasyonunu net bir şekilde ayırt etmek için bu kafesleri etiketle. İlgili erkek bardaklarını etiketlere göre çiftleşme kafeslerine yerleştirin.
Ağı çıkarın ve erkekleri fincandan çıkarmak için yavaşça bardağa dokunun. Hiçbir sivrisineğin kafesten kaçmamasını sağlamak için kağıt bardağı ve ağı dikkatlice kafesten çıkarın. Erkek sivrisineklerin çiftleşme kafesine en az bir saat alışmasına izin verin.
Oral bir aspiratör kullanarak, bakire vahşi tip dişi sivrisinekleri, her bardak 10 sivrisinek içeren 12 kağıt bardağa aktarın. Erkek sivrisinekler için alışma döneminden sonra, her çiftleşme kafesine bir bardak dişi aktarın ve ağı çıkarın. Kalan dişi sivrisinekleri fincandan teşvik etmek için fincanı hafifçe itin, ardından hiçbir sivrisineklerin kafesten kaçmamasını sağlamak için kağıt bardağı ve ağı dikkatlice kafesten çıkarın.
Çiftleşmenin üç saat boyunca gerçekleşmesine izin verin ve ardından mekanik bir aspiratör ile her kafesten tüm sivrisinekleri çıkararak çiftleşme deneyini sonlandırın. Sivrisinekleri buz üzerinde en az beş dakika soğuk uyuşturun. Sivrisinekler tamamen uyuşturulduğu zaman, dişi sivrisinekleri hafifçe toplayın ve ağ ile sabitlenmiş ayrı bir kağıt bardağa barındırın.
Kağıt kabı, ilgili etiketi çiftleşme kafesinden bardağa aktararak etiketleyin. Dişi spermathecae puanlamak için, bir stereo mikroskop altında diseksiyondan önce en az beş dakika boyunca buz üzerinde dişi sivrisinekleri soğuk uyuşturun. Dişi sivrisinekleri stereo mikroskop altında parçalara ayrıştırın.
Spermathecae'yi mikroskop altında inceleyin. Dişi döllenmezse, üç spermathecae de boş olur ve döllenirse spermathecae'nin iki veya üçü hareketli spermle doldurulur. Döllenmiş bireyler için, spermathecae'nin Rhodamine B işaretli seminal sıvı içerip içermediğini, RFP1 filtresi ile donatılmış floresan stereo mikroskop altında inceleyerek belirleyin.
Spermathecae, Rhodamine B ile işaretlenmemiş seminal sıvı ile doldurulursa, floresan gözlenmez. Öte yandan, spermatheca Rhodamine B işaretli seminal sıvı içeriyorsa, floresan turuncu olurdu. Bu çiftleşme rekabet tahlilinin amacı, birkaç nesil akraba evliliğinden sonra erkek çiftleşme zindeliğinde bir kayıp olup olmadığını belirlemekti.
Çiftleşme rekabet gücü testinin deneysel triplicates yapıldı ve tohumlama verileri burada gösterilmiştir. Yabani tip dişiler, karşılıklı işaretle, doğuştan veya outcross erkekler tarafından döllendi. Sonuçlar, doğuştan veya dıştan doğmuş erkekler tarafından döllenen kadınların oranının Rhodamine B işaretinden etkilenmediğini göstermektedir.
Kadınların önemli ölçüde daha yüksek bir yüzdesi, her üç kopyadaki doğuştan gelen erkeklere göre outcross erkeklerle çiftleşti, bu da akraba evliliğinin çiftleşme zindeliğinde kayba yol açabileceğini gösteriyor. Dişi sivrisineklerin ekstra kafeslerini hazırlamak önemlidir. Önceden döllenmiş dişiler tüm verileri geçersiz kılacağından, erkek sivrisinekler tarafından kontamine olmuş bir kafesten dişi sivrisinekler kullanmayın.
Laboratuvar tabanlı çiftleşme rekabet gücü tahlilleri dışında, bu prosedür böcek çiftleşme biyolojisini, popülasyon dinamiklerini ve dağılımını incelemek için mark release-recapture deneylerinde kullanılabilir.
