使用Trowell型器官培养研究牙科干细胞的调节

Trowell型器官培养用于培养组织外植体。在这里，我们展示了如何使用这种方法来研究连续生长的牙齿中的干细胞。通过这种技术，我们可以研究干细胞及其在生态位中的行为，并筛选各种分子对干细胞存活和维持的影响。

这种方法也可以应用于研究其他器官的干细胞，例如皮肤或乳腺。首先在 35 毫米培养皿中放置带有 1 到 2 毫米直径孔的 35 毫米金属网格。用介质填充该位置，直到介质到达网格表面。

然后，将板在37摄氏度下孵育，直到组织被分离并准备培养。斩首小鼠后，去除皮肤以露出下颌骨，并切开咬肌以将下颌骨与上颌骨和头部其余部分分开。分离下颌骨后，切除舌头和最大软组织。

通过切开联合在中线分开下颌骨。将下颌骨放在冰上含有PBS的培养皿中。使用一次性 20 x 26 号皮下注射针解剖门牙。

然后，清洁骨骼表面的软组织和肌肉组织，以获得更好的可视化效果。对于从小于 10 天的动物身上获得的下颌骨，使用一次性 20 x 26 号皮下注射针纵向打开下颌骨的每一半以露出门牙。轻轻地将门牙与周围的骨头分离。

切开包含颈环的近端，去除矿化牙釉质和牙本质基质。将收集的近端保存在Dulbecco的PBS中，直到准备好培养。对于超过10天的小鼠，纵向打开下颌骨的每一半以露出门牙。

用镊子夹住下颌骨，折断骨头露出牙齿。切开包含颈环的近端。将收集的近端保存在Dulbecco的PBS中，直到准备好培养。

小心地将矩形过滤器放在预热培养皿中的网格顶部，并正确定向组织碎片。将板在 37 摄氏度、5% 二氧化碳和 90% 至 95% 湿度下孵育。隔天小心更换培养基，避免形成气泡。

每天监测组织生长并捕获图像。从培养皿中取出培养基，小心地将冰冷的甲醇添加到组织中。然后，将其孵育五分钟。

将携带组织外植体的过滤器转移到装有固定溶液的采样管中。将外植体固定在PBS中制备的4%多聚甲醛中，最多在4摄氏度下过夜。上皮干细胞位于称为颈环的壁龛中，位于门牙的近端。

颈袢包括一个内釉质上皮和外釉质上皮，其包裹着星状网，星状网是松散排列的上皮细胞的核心。每个门牙都有一个唇袢和一个舌颈袢，但只有唇颈袢含有干细胞。捕获从出生后两天的Sox2-GFP小鼠中分离的门牙的近端，从而能够识别和可视化表达Sox2的切牙上皮干细胞。

在从Sox2-GFP和Fucci红色转基因小鼠分离的宫颈环中，鉴定出GFP阳性干细胞和Fucci红阳性非增殖细胞。将Sox2-GFP表达作为报告基因分析Wnt/β-连环蛋白信号激活剂BIO对表达Sox2的干细胞以及GFP表达产生负面影响。该技术可以针对干细胞行为的实时成像进行优化。

压制或培养的外植体也可以酶处理成单细胞悬浮液以进行进一步分析。