תרבית איברים מסוג טרוול משמשת לתרבית רקמות. כאן אנו מראים כיצד להשתמש בשיטה זו כדי לחקור את תאי הגזע בשיניים הגדלות ברציפות. בעזרת טכניקה זו אנו יכולים לחקור את תאי הגזע ואת התנהגותם בנישה ולסנן את ההשפעה של מולקולות שונות על הישרדותם ותחזוקתם של תאי גזע.
שיטה זו יכולה להיות מיושמת כדי לחקור את תאי הגזע של איברים אחרים גם כן, כגון עור או בלוטת החלב. התחילו בהצבת רשתות מתכת בקוטר 30 מילימטר עם חורים בקוטר של מילימטר עד שניים בצלחת פטרי של 35 מילימטר. מלאו את המקום במדיה עד שהמדיה תגיע למשטח הרשת.
לאחר מכן, לדגור את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס עד הרקמה מבודדת ומוכנה לתרבית. לאחר עריפת העכבר, הסר את העור כדי לחשוף את המנדיבל וחתך דרך שרירי המאסה כדי להפריד את המנדיבל מהמקסילה ושאר הראש. לאחר בידוד המנדיבל, הסר את הלשון ואת הרקמה הרכה המקסימלית.
פיצול המנדיבל בקו האמצע על ידי חיתוך דרך הסימפיזה. מניחים את המנדיבל בצלחת פטרי המכילה PBS על הקרח. השתמש במחט היפודרמית חד פעמית בגודל 20 על 26 כדי לנתח את החותך.
לאחר מכן, נקו את הרקמה הרכה ורקמת השריר מפני השטח של העצם להדמיה טובה יותר. עבור מנדיבלים המתקבלים מבעלי חיים מתחת לגיל 10 ימים, השתמש במחטים היפודרמיות חד פעמיות בגודל 20 על 26 כדי לפתוח כל מחצית מהמנדיבל לאורכו כדי לחשוף את השן החותכת. יש לנתק בעדינות את החותך מהעצם שמסביב.
חותכים את הקצה הפרוקסימלי המכיל את לולאת צוואר הרחם ומסירים את האמייל המינרלי ואת מטריצת הדנטין. שמור את הקצוות הפרוקסימליים שנאספו ב- PBS של דולבקו על הקרח עד שיהיה מוכן לתרבית. לעכברים שגילם עולה על 10 ימים, יש לפתוח כל מחצית מהמנדיבל לאורכו כדי לחשוף את השן החותכת.
השתמש בפינצטה כדי לאחוז את המנדיבל ולשבור את העצם כדי לחשוף את השן. חותכים את הקצה הפרוקסימלי המכיל את לולאת צוואר הרחם. שמור את הקצוות הפרוקסימליים שנאספו ב- PBS של דולבקו על הקרח עד שיהיה מוכן לתרבית.
מניחים בזהירות את מסנני המלבן על גבי הרשת בצלחת תרבית שחוממה מראש ומכוונים כראוי את חתיכות הרקמה. יש לדגור על הצלחת ב-37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו-חמצני ולחות של 90%-95%. בזהירות לשנות את המדיום בימים חלופיים, הימנעות היווצרות של בועות אוויר.
עקוב אחר צמיחת הרקמות ולכוד תמונות מדי יום. מוציאים את מדיום התרבית מהמנה ומוסיפים בזהירות מתנול קר כקרח לרקמה. לאחר מכן, לדגור אותו במשך חמש דקות.
העבירו מסנן הנושא את יציאת הרקמה לצינור הדגימה המלא בתמיסת קיבוע. לתקן את explant ב 4% paraformaldehyde מוכן PBS עבור לילה מקסימלי בארבע מעלות צלזיוס. תאי הגזע האפיתליאליים שוכנים בנישה הנקראת לולאת צוואר הרחם, הממוקמת בקצה הפרוקסימלי של החותך.
הלולאה הצווארית כוללת אפיתל אמייל פנימי וחיצוני העוטף את הרשתית הסטלית, ליבה של תאי אפיתל המסודרים באופן רופף. לכל חותך יש לולאת צוואר רחם אחת ולולאה צווארית לשונית אחת, אך רק לולאת צוואר הרחם הלבבית מכילה את תאי הגזע. הקצה הפרוקסימלי של החותך, שבודד מעכברי Sox2-GFP לאחר הלידה, נלכד, מה שאפשר זיהוי והדמיה של תאי גזע אפיתל חותכים המבטאים Sox2.
בלולאות צוואר הרחם שבודדו מהעכברים המהונדסים האדומים Sox2-GFP ו-Fucci, זוהו תאי גזע חיוביים ל-GFP ותאי פוצ'י-אדומים-חיוביים שאינם מתרבים. הביטוי Sox2-GFP שימש ככתב לניתוח ההשפעה של מפעיל האיתות Wnt/beta-catenin BIO, שהשפיע לרעה על תאי גזע המבטאים Sox2, כמו גם על ביטוי ה-GFP. טכניקה זו יכולה להיות מותאמת להדמיה חיה של התנהגות תאי הגזע.
ניתן גם לעבד צמחים דחוסים או בתרבית באופן אנזימטי לתרחיפים חד-תאיים לצורך ניתוח נוסף.
