La culture d’organes de type Trowell est utilisée pour cultiver des explants de tissus. Ici, nous montrons comment utiliser cette méthode pour étudier les cellules souches dans les dents en croissance continue. Avec cette technique, nous pouvons étudier les cellules souches et leur comportement dans la niche et cribler l’effet de diverses molécules sur la survie et le maintien des cellules souches.
Cette méthode peut également être appliquée pour étudier les cellules souches d’autres organes, tels que la peau ou la glande mammaire. Commencez par placer des grilles métalliques de 30 millimètres avec des trous d’un à deux millimètres de diamètre dans une boîte de Petri de 35 millimètres. Remplissez l’endroit avec des médias jusqu’à ce qu’ils atteignent la surface de la grille.
Ensuite, incuber la plaque à 37 degrés Celsius jusqu’à ce que le tissu soit isolé et prêt à être mis en culture. Après avoir décapité la souris, retirez la peau pour exposer la mandibule et coupez les muscles masséters pour séparer la mandibule du maxillaire et du reste de la tête. Une fois la mandibule isolée, retirez la langue et un maximum de tissus mous.
Diviser la mandibule à la ligne médiane en coupant à travers la symphyse. Placer la mandibule dans la boîte de Petri contenant du PBS sur la glace. Utilisez une aiguille hypodermique jetable de calibre 20 par 26 pour disséquer l’incisire.
Ensuite, nettoyez les tissus mous et les tissus musculaires de la surface osseuse pour une meilleure visualisation. Pour les mandibules obtenues à partir d’animaux de moins de 10 jours, utiliser des aiguilles hypodermiques jetables de calibre 20 par 26 pour ouvrir chaque moitié de la mandibule longitudinalement afin d’exposer la dent incisive. Détachez doucement l’incisive de l’os environnant.
Coupez l’extrémité proximale qui contient la boucle cervicale et retirez l’émail minéralisé et la matrice dentine. Gardez les extrémités proximales recueillies dans le PBS de Dulbecco sur la glace jusqu’à ce qu’elles soient prêtes à être cultivées. Pour les souris de plus de 10 jours, ouvrir chaque moitié de la mandibule longitudinalement pour exposer l’incisive.
Utilisez une pince à épiler pour saisir la mandibule et casser l’os pour exposer la dent. Coupez l’extrémité proximale qui contient la boucle cervicale. Gardez les extrémités proximales recueillies dans le PBS de Dulbecco sur la glace jusqu’à ce qu’elles soient prêtes à être cultivées.
Placez soigneusement les filtres rectangulaires sur le dessus de la grille dans une boîte de culture préchauffée et orientez correctement les morceaux de tissu. Incuber la plaque à 37 degrés Celsius, 5% de dioxyde de carbone et 90 à 95% d’humidité. Changez soigneusement le milieu un jour sur deux, en évitant la formation de bulles d’air.
Surveillez la croissance des tissus et capturez des images quotidiennement. Retirez le milieu de culture de la capsule et ajoutez délicatement du méthanol glacé dans le tissu. Ensuite, incuber pendant cinq minutes.
Transférer un filtre transportant l’explant tissulaire dans le tube de prélèvement rempli de solution fixatrice. Fixer l’explant dans du paraformaldéhyde à 4% préparé dans du PBS pour une nuit maximale à quatre degrés Celsius. Les cellules souches épithéliales résident dans une niche appelée la boucle cervicale, située à l’extrémité proximale de l’incisive.
La boucle cervicale comprend un épithélium d’émail interne et externe qui enveloppe le réticulum étoilé, un noyau de cellules épithéliales disposées de manière lâche. Chaque incisive a une anse cervicale labiale et une anse cervicale linguale, mais seule la boucle cervicale labiale contient les cellules souches. L’extrémité proximale d’une incisire, isolée de souris Sox2-GFP postnatales de deux jours, a été capturée, permettant l’identification et la visualisation des cellules souches épithéliales incisives exprimant Sox2.
Dans les anses cervicales isolées des souris transgéniques Sox2-GFP et rouge Fucci, des cellules souches GFP positives et des cellules non prolifératives Fucci-rouge positif ont été identifiées. L’expression Sox2-GFP a été utilisée comme rapporteur pour analyser l’effet de l’activateur de signalisation Wnt/bêta-caténine BIO, qui a affecté négativement les cellules souches exprimant Sox2 ainsi que l’expression GFP. Cette technique peut être optimisée pour l’imagerie en direct du comportement des cellules souches.
Les explants pressés ou cultivés peuvent également être traités par voie enzymatique en suspensions unicellulaires pour une analyse plus approfondie.
