トロウェル型臓器培養は、組織外植片の培養に使用されます。ここでは、この方法を使用して、継続的に成長する歯の幹細胞を研究する方法を示します。この技術により、幹細胞とそのニッチでの挙動を研究し、幹細胞の生存と維持に対するさまざまな分子の影響をスクリーニングすることができます。
この方法は、皮膚や乳腺などの他の臓器の幹細胞の研究にも適用できます。まず、直径1〜2ミリメートルの穴のある30ミリメートルの金属グリッドを35ミリメートルのペトリ皿に配置します。メディアがグリッド表面に到達するまで、その場所をメディアで満たします。
次に、組織が分離されて培養の準備が整うまで、プレートを摂氏37度でインキュベートします。マウスを斬首した後、皮膚を切除して下顎骨を露出させ、咬筋を切り裂いて下顎骨を上顎骨と頭の残りの部分から分離します。下顎骨が分離されたら、舌と最大の軟部組織を取り除きます。
結合を切り裂いて正中線で下顎骨を分割します。氷の上にPBSを含むペトリ皿に下顎骨を置きます。使い捨ての20 x 26ゲージの皮下注射針を使用して、切歯を解剖します。
次に、骨の表面から軟組織と筋肉組織をきれいにして、視覚化を改善します。10日未満の動物から得られた下顎骨の場合は、使い捨ての20 x 26ゲージの皮下注射針を使用して下顎骨の各半分を縦方向に開き、切歯を露出させます。切歯を周囲の骨からそっと外します。
頸部ループを含む近位端を切り取り、石灰化したエナメル質と象牙質マトリックスを取り除きます。採取した近位端を、培養の準備ができるまで氷上でダルベッコのPBSに保管します。10日以上経過したマウスの場合は、下顎骨の各半分を縦方向に開いて切歯を露出させます。
ピンセットを使用して下顎骨をつかみ、骨を折って歯を露出させます。頸部ループを含む近位端を切断します。採取した近位端を、培養の準備ができるまで氷上でダルベッコのPBSに保管します。
長方形のフィルターを事前に温めた培養皿のグリッドの上に慎重に置き、組織片を適切に向けます。プレートを摂氏37度、二酸化炭素5%、湿度90〜95%でインキュベートします。気泡の形成を避けて、隔日に培地を慎重に交換してください。
組織の成長を監視し、毎日画像をキャプチャします。皿から培地を取り出し、氷冷メタノールを組織に注意深く加えます。その後、5分間インキュベートします。
組織外植片を運ぶフィルターを固定液で満たされたサンプリングチューブに移します。外植片をPBSで調製した4%パラホルムアルデヒドに固定し、摂氏4度で一晩最大にします。上皮幹細胞は、切歯の近位端に位置する頸部ループと呼ばれるニッチに存在する。
頸部ループは、緩く配置された上皮細胞のコアである星状網を包む内側と外側のエナメル質上皮で構成されています。各切歯には1つの唇と1つの舌の頸部ループがありますが、唇頸部ループにのみ幹細胞が含まれています。生後2日目のSox2-GFPマウスから単離した切歯の近位端を捕捉し、Sox2発現切歯上皮幹細胞の同定と可視化を可能にしました。
Sox2-GFPおよびFucci赤色トランスジェニックマウスから単離された子宮頸部ループにおいて、GFP陽性幹細胞およびフッチ赤色陽性非増殖細胞が同定された。Sox2-GFP発現は、Sox2発現幹細胞およびGFP発現に悪影響を与えるWnt/β-カテニンシグナル伝達活性化因子BIOの効果を分析するためのレポーターとして使用されました。この技術は、幹細胞の挙動のライブイメージングに最適化できます。
プレスまたは培養された外植片は、さらなる分析のために単一細胞懸濁液に酵素的に処理することもできます。
