Trowell tipi organ kültürü, doku eksplantlarını kültürlemek için kullanılır. Burada, sürekli büyüyen dişlerdeki kök hücreleri incelemek için bu yöntemin nasıl kullanılacağını gösteriyoruz. Bu teknikle, kök hücreleri ve niş içindeki davranışlarını inceleyebilir ve çeşitli moleküllerin kök hücrelerin hayatta kalması ve bakımı üzerindeki etkisini tarayabiliriz.
Bu yöntem, cilt veya meme bezi gibi diğer organların kök hücrelerini incelemek için de uygulanabilir. 35 milimetrelik bir Petri kabına bir ila iki milimetre çapında delikler içeren 30 milimetrelik metal ızgaralar yerleştirerek başlayın. Ortam ızgara yüzeyine ulaşana kadar yeri ortamla doldurun.
Daha sonra, doku izole edilene ve kültüre hazır olana kadar plakayı 37 santigrat derecede inkübe edin. Farenin kafasını kestikten sonra, mandibulayı açığa çıkarmak için cildi çıkarın ve mandibulayı maksilladan ve başın geri kalanından ayırmak için masseter kaslarını kesin. Mandibula izole edildikten sonra, dili ve maksimum yumuşak dokuyu çıkarın.
Simfizisi keserek orta hattaki mandibulayı bölün. Mandibulayı buzun üzerine PBS içeren Petri kabına yerleştirin. Kesici dişleri diseke etmek için tek kullanımlık 20 x 26 gauge hipodermik iğne kullanın.
Ardından, daha iyi görselleştirme için yumuşak dokuyu ve kas dokusunu kemik yüzeyinden temizleyin. 10 günden küçük hayvanlardan elde edilen mandibulalar için, kesici dişi açığa çıkarmak için mandibulanın her yarısını uzunlamasına açmak için tek kullanımlık 20 x 26 gauge hipodermik iğneler kullanın. Kesici kesiciyi çevreleyen kemikten yavaşça ayırın.
Servikal döngüyü içeren proksimal ucu kesin ve mineralize emaye ve dentin matrisini çıkarın. Dulbecco'nun PBS'sinde toplanan proksimal uçları kültüre hazır olana kadar buz üzerinde tutun. 10 günden eski fareler için, kesici dişi açığa çıkarmak için mandibulanın her yarısını uzunlamasına açın.
Mandibulayı kavramak için cımbız kullanın ve dişi açığa çıkarmak için kemiği kırın. Servikal döngüyü içeren proksimal ucu kesin. Dulbecco'nun PBS'sinde toplanan proksimal uçları kültüre hazır olana kadar buz üzerinde tutun.
Dikdörtgen filtreleri ızgaranın üstüne önceden ısıtılmış bir kültür kabına dikkatlice yerleştirin ve doku parçalarını uygun şekilde yönlendirin. Plakayı 37 santigrat derecede,% 5 karbondioksitte ve% 90 ila% 95 nemde inkübe edin. Hava kabarcığı oluşumunu önleyerek alternatif günlerde ortamı dikkatlice değiştirin.
Doku büyümesini izleyin ve günlük görüntüler yakalayın. Kültür ortamını çanaktan çıkarın ve dokuya buz gibi soğuk metanolü dikkatlice ekleyin. Ardından, beş dakika boyunca kuluçkaya yatırın.
Doku eksplantını taşıyan bir filtreyi, sabitleme çözeltisi ile doldurulmuş numune alma tüpüne aktarın. Eksplantı, PBS'de hazırlanan% 4'lük paraformaldehit içinde, maksimum gece boyunca dört santigrat derecede sabitleyin. Epitel kök hücreleri, kesici dişin proksimal ucunda bulunan servikal döngü adı verilen bir niş içinde bulunur.
Servikal döngü, gevşek düzenlenmiş epitel hücrelerinin bir çekirdeği olan yıldız retikulumunu kaplayan bir iç ve dış emaye epitelini içerir. Her kesici dişin bir labial ve bir lingual servikal döngüsü vardır, ancak sadece labial servikal döngü kök hücreleri içerir. İki günlük doğum sonrası Sox2-GFP farelerinden izole edilen bir kesici dişin proksimal ucu yakalandı ve Sox2 eksprese eden kesici epitel kök hücrelerinin tanımlanması ve görselleştirilmesi sağlandı.
Sox2-GFP ve Fucci kırmızı transgenik farelerden izole edilen servikal döngülerde, GFP-pozitif kök hücreler ve Fucci-kırmızı-pozitif proliferatif olmayan hücreler tanımlandı. Sox2-GFP ekspresyonu, Sox2 ekspresyonunu ve GFP ekspresyonunu olumsuz yönde etkileyen Wnt / beta-katenin sinyal aktivatörü BIO'nun etkisini analiz etmek için bir muhabir olarak kullanıldı. Bu teknik, kök hücre davranışının canlı görüntülenmesi için optimize edilebilir.
Preslenmiş veya kültürlenmiş eksplantlar, daha fazla analiz için enzimatik olarak tek hücreli süspansiyonlara da işlenebilir.
