La coltura di organi di tipo Trowell viene utilizzata per la coltura di espianti di tessuti. Qui, mostriamo come utilizzare questo metodo per studiare le cellule staminali nei denti a crescita continua. Con questa tecnica, possiamo studiare le cellule staminali e il loro comportamento nella nicchia e schermare l'effetto di varie molecole sulla sopravvivenza e il mantenimento delle cellule staminali.
Questo metodo può essere applicato per studiare le cellule staminali di altri organi, come la pelle o la ghiandola mammaria. Inizia posizionando griglie metalliche da 30 millimetri con fori da uno a due millimetri di diametro in una capsula di Petri da 35 millimetri. Riempite il contenuto con il supporto fino a quando il supporto non raggiunge la superficie della griglia.
Quindi, incubare la piastra a 37 gradi Celsius fino a quando il tessuto è isolato e pronto per la coltura. Dopo aver decapitato il topo, rimuovere la pelle per esporre la mandibola e tagliare i muscoli masseteri per separare la mandibola dalla mascella e dal resto della testa. Una volta isolata la mandibola, rimuovere la lingua e il massimo dei tessuti molli.
Dividere la mandibola sulla linea mediana tagliando la sinfisi. Posizionare la mandibola nella capsula di Petri contenente PBS sul ghiaccio. Utilizzare un ago ipodermico monouso da 20 x 26 gauge per sezionare l'incisivo.
Quindi, pulire i tessuti molli e il tessuto muscolare dalla superficie ossea per una migliore visualizzazione. Per le mandibole ottenute da animali di età inferiore ai 10 giorni, utilizzare aghi ipodermici monouso da 20 x 26 gauge per aprire longitudinalmente ciascuna metà della mandibola per esporre il dente incisivo. Staccare delicatamente l'incisivo dall'osso circostante.
Tagliare l'estremità prossimale che contiene l'ansa cervicale e rimuovere lo smalto mineralizzato e la matrice dentinica. Conservare le estremità prossimali raccolte nel PBS di Dulbecco sul ghiaccio fino al momento della coltivazione. Per i topi di età superiore a 10 giorni, aprire longitudinalmente ciascuna metà della mandibola per esporre il dente incisivo.
Usa una pinzetta per afferrare la mandibola e rompere l'osso per esporre il dente. Tagliare l'estremità prossimale che contiene l'ansa cervicale. Conservare le estremità prossimali raccolte nel PBS di Dulbecco sul ghiaccio fino al momento della coltivazione.
Posizionare con attenzione i filtri rettangolari sulla parte superiore della griglia in un piatto di coltura preriscaldato e orientare correttamente i pezzi di tessuto. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica e 90-95% di umidità. Cambiare con attenzione il mezzo a giorni alterni, evitando la formazione di bolle d'aria.
Monitorare la crescita dei tessuti e catturare immagini ogni giorno. Rimuovere il terreno di coltura dal piatto e aggiungere con attenzione metanolo ghiacciato al tessuto. Quindi, incubarlo per cinque minuti.
Trasferire un filtro che trasporta l'espianto di tessuto nella provetta di campionamento riempita con soluzione di fissaggio. Fissare l'espianto in paraformaldeide al 4% preparato in PBS per la massima notte a quattro gradi Celsius. Le cellule staminali epiteliali risiedono in una nicchia chiamata ansa cervicale, situata all'estremità prossimale dell'incisivo.
L'ansa cervicale comprende un epitelio smaltato interno ed esterno che racchiude il reticolo stellato, un nucleo di cellule epiteliali disposte in modo approssimativo. Ogni incisivo ha un'ansa cervicale labiale e una linguale, ma solo l'ansa cervicale labiale contiene le cellule staminali. L'estremità prossimale di un incisivo, isolata da topi Sox2-GFP postnatali di due giorni, è stata catturata, consentendo l'identificazione e la visualizzazione delle cellule staminali epiteliali incisive che esprimono Sox2.
Nelle anse cervicali isolate dai topi transgenici rossi Sox2-GFP e Fucci, sono state identificate cellule staminali GFP-positive e cellule non proliferative Fucci-rosso-positive. L'espressione di Sox2-GFP è stata utilizzata come reporter per analizzare l'effetto dell'attivatore di segnalazione Wnt / beta-catenina BIO, che ha influenzato negativamente le cellule staminali che esprimono Sox2 e l'espressione di GFP. Questa tecnica può essere ottimizzata per l'imaging dal vivo del comportamento delle cellule staminali.
Gli espianti pressati o coltivati possono anche essere trattati enzimaticamente in sospensioni monocellulari per ulteriori analisi.
