心血管疾病仍然是全世界头号死因。传统的体外模型依赖于单层文化。然而，心脏，特别是心肌或心肌，其3D异位和细胞组成是复杂的。
因此，改善体外模型内组织成分的复杂性，以更好地模拟细胞成分和心肌结构至关重要。在这项工作中，我们演示了在新型微流体装置中开发3D成熟干细胞衍生人类心脏组织的方案。该设备结合了一个3D主组织通道与与生俱来的椭圆微柱，诱导周围水凝胶封装心脏细胞的高度对齐。
主通道的两侧是带注射端口的介质通道，使营养物质在整个组织中扩散。由于处理微流体设备需要小心，此协议的视觉表示有助于在微流体设备内正确建立 3D 心脏组织，并嵌入微柱以增强组织对齐。要分离人类心脏成纤维细胞，首先从孵化器取出烧瓶。
放入生物安全柜内，开始从烧瓶中吸气。然后采取三个ML的PBS 1X洗烧瓶。关闭盖子并旋转烧瓶，以便底部正确涂上 PBS。
吸气 PBS。服用三个 37 度试穿素的 Mls， 并添加到烧瓶中。然后倾斜烧瓶和漩涡，使底部完全涂层。
然后放入孵化器四到六分钟。通过服用三个 Mls 并将它添加到烧瓶中， 用 Fgm3 中和肌素。将溶液上下移出，以去掉留在烧瓶背面的任何细胞。
将细胞悬架收集到 15 ML 猎鹰管中。取10微升的细胞悬浮，并在血细胞仪中分配，用显微镜数细胞。将细胞悬浮在250 G下悬架4分钟。
离心后，吸气超自然者小心不要干扰细胞颗粒。用新鲜的 FGM3 补充细胞颗粒，使每个 ML 悬架产生所需的 7500 万个细胞。重新安装细胞，然后用松散安装的盖子将管子放下。
要分离心肌细胞，请将盘子从孵化器中取出，并吸气介质。取六个 PBS 的 MLs 并清洗油井，以便每口井中有一个 PBS 的 ML。吸气 PBS，小心不要打扰连接到板上的细胞。
添加六个 MLs 的加热尝试快车， 以便有一个 Ml 在六个井板的每口井。用试管孵化细胞10分钟。10 分钟后，用 6 毫升的 RPMI 加 B27 加胰岛素中和 trypLE，以便您在每个井中添加一个 ML 的 RMPI。
使用一个ML移液器收集溶液，并将其爆炸到井的背面，以确保所有细胞被解除。将细胞悬架收集到 15 ML 猎鹰管中。在300G下将管子离心三分钟。
离心后，吸气媒体和试用。这一步对于洗涤敏感的心肌细胞很重要。此步骤确保所有尝试在 3D 心脏组织形成中消失。
将细胞颗粒在 RPMI 加 B27 加胰岛素的五个 MLs 中恢复。使用单ML移液器上下移液，以确保细胞悬架均匀。使用血细胞计计数时，取 10 微升的细胞悬架。
将细胞在300G下离心三分钟。第二次离心后向媒体发号限供。添加适量的RPMI加B27加胰岛素，实现每个ML悬浮7500万个细胞，然后恢复。
要准备用于封装的胶原蛋白溶液，请将所有试剂放在引擎盖中的冰盒上。然后服用75微升的库存胶原蛋白。胶原蛋白非常粘稠，所以慢慢吸收移液器，然后在冰上的微中微管中分配。
服用 13.85 微升 RPMI，加入猎鹰管中的胶原蛋白。然后服用10微升酚红色，加入冰上的混合物，然后再补充。最后，取1.15微升的一个正常的NaOH，并添加到悬架中和。
然后采取200微升移液器尖端，并恢复悬架。下一步是将胶原蛋白都市体中的细胞封装起来。然后取8微升的CMs，并添加到冰上一个新的猎鹰管。
然后取两微升CS，并添加到该细胞混合物中。恢复细胞悬架，抓住细胞悬架的5.6微升，放入一个新的猎鹰管。然后抓住你刚刚准备的胶原蛋白，取四微升胶原蛋白，然后取2.4微升的麦德龙。
将混合物上下起伏，以确保细胞水凝胶悬架的均匀分布。准备好凝胶注射后，您可以插入设备。采取一个新的提示，并重新发送。
拿培养皿的设备，插入注射端口的尖端，缓慢而稳定地注射。当设备通道充满细胞水凝胶悬架时，您将看到。填充其他端口后，停止注注并移除尖端。
注射后，用钳子翻转设备，放在更大的培养皿内，在孵化器中注水九分钟。九分钟后，将设备从孵化器中取出并直立翻转，然后放回孵化器中 9 分钟，完成水凝胶聚合。现在是时候添加媒体了。
因此，将 RMPI 加 B27 放入媒体端口，然后开始缓慢推动。然后在相反的媒体端口上这样做。您可能会发现媒体没有注射，因此您可以在端口顶部放置一滴介质，然后取出移液器，使用负压力将介质从另一侧拉过。
因此，你会看到媒体开始通过渠道拉。一旦媒体被添加到所有媒体频道，设备将被放回37度的孵化器中。微流体设备显示在左上角。
第一天、第七天和第十四天展示了这张图片。经过14天的培养后，细胞应凝结成围绕微柱形成的高度对齐结构。第14天的痕迹显示在自发收缩的C中，以及作用性染色和心脏标记染色组织的免疫荧光图像。
应该看到的是高度对齐的在文化中形成的14天后形成的纤维，以及平行条纹成熟的肉瘤和局部的缝隙交汇点。在此过程中，在细胞水凝胶注射期间，必须保持所有材料在冰上保持低温，以防止过早聚合。在制造、注射和扩展组织培养过程中，应小心处理微流体设备。
细胞注射应该是一个稳定的过程，以确保整个通道已经充满，同时快速执行，以防止过早聚合或水凝胶干燥之前，媒体添加。
