Les maladies cardiovasculaires demeurent la première cause de décès dans le monde. Les modèles in vitro traditionnels reposent sur la culture monocouche. Cependant, le cœur, en particulier le muscle cardiaque ou le myocarde, est complexe dans son anisotropie 3D et sa composition cellulaire.
Par conséquent, il est essentiel d’améliorer la complexité de la composition tissulaire dans les modèles in vitro pour mieux imiter à la fois les constituants cellulaires et la structure du myocarde. Ici, dans ce travail, nous démontrons un protocole pour le développement d’un tissu cardiaque humain dérivé de cellules souches matures 3D dans un nouveau dispositif microfluidique. Ce dispositif intègre un canal tissulaire principal 3D avec des micropostes elliptiques innés qui induisent des degrés élevés d’alignement des cellules cardiaques encapsulées par hydrogel environnant.
Le canal principal est flanqué de canaux médiatiques avec des ports d’injection qui permettent une diffusion des nutriments dans tout le tissu. En raison du soin exigé dans la manipulation des dispositifs microfluidiques, la représentation visuelle de ce protocole est utile pour établir correctement le tissu cardiaque 3D dans un dispositif microfluidique avec les micropostes incorporés pour l’alignement accru de tissu. Pour dissocier le fibroblaste cardiaque humain, sortez d’abord le ballon de l’incubateur.
Mettez à l’intérieur de l’armoire de biosécurité et commencez à aspirer les milieux usés du ballon. Ensuite, prenez trois ML de PBS 1X pour laver le ballon. Fermez le bouchon et faire pivoter le ballon de manière à ce que le fond soit correctement recouvert de PBS.
Aspirez le système de fourchettes de prix. Prendre trois ML de trypsine à 37 degrés et ajouter à la fiole. Inclinez ensuite le ballon et faites pivoter de sorte que le fond soit entièrement recouvert.
Ensuite, mettez dans l’incubateur pendant quatre à six minutes. Neutraliser la trypsine avec la MGF3 en prenant trois ML et en ajoutant cela au ballon. Pipetter la solution de haut en bas pour déloger les cellules qui restent à l’arrière du ballon.
Recueillir la suspension cellulaire dans un tube Falcon de 15 ML. Prenez 10 microlitres de la suspension cellulaire et distribuez-les dans un hémocytomètre pour compter les cellules avec un microscope. Centrifuger la suspension cellulaire à 250 G pendant quatre minutes.
Après centrifugation, aspirer le surnageant en faisant attention à ne pas perturber le culot cellulaire. Ressuscitez le culot cellulaire avec FGM3 frais pour faire un désiré 75 millions de cellules par suspension ml. Ressuscitez les cellules, puis réglez le tube avec un capuchon lâchement ajusté.
Pour dissocier les cardiomyocytes, sortez la plaque de l’incubateur et aspirez le support. Prenez six ML de PBS et lavez les puits de sorte qu’il y ait un ML de PBS dans chaque puits. Aspirer le PBS, en prenant soin de ne pas perturber les cellules attachées à la plaque.
Ajoutez six ML de trypLE Express chauffé afin qu’il y ait un ML dans chaque puits d’une plaque de six puits. Incuber les cellules avec le trypLE pendant 10 minutes. Après 10 minutes, neutralisez le trypLE avec six ML de RPMI plus B27 plus insuline afin d’ajouter un ML de RMPI à chaque puits.
Utilisez une pipette ML pour recueillir la solution et faites-la sauter contre l’arrière des puits pour vous assurer que toutes les cellules sont soulevées. Recueillir la suspension cellulaire dans un tube Falcon de 15 ML. Centrifuger le tube à 300 G pendant trois minutes.
Après centrifugation, aspirer le support et la trypLE. Cette étape est importante pour laver les cardiomyocytes sensibles. Cette étape garantit que tout le trypLE a disparu dans la formation de tissu cardiaque 3D.
Ressusciter la pastille de cellules dans cinq MLs de RPMI plus B27 plus insuline. Utilisez une pipette d’un ML pour pipetter la solution de haut en bas afin d’assurer une suspension de cellule homogène. Prenez 10 microlitres de la suspension cellulaire pour compter avec l’hémocytomètre.
Centrifuger les cellules à 300 G pendant trois minutes. Aspirer le support après centrifugation pour la deuxième fois. Ajoutez la quantité appropriée de RPMI plus B27 plus insuline pour obtenir une suspension de 75 millions de cellules par ML, puis ressuscitez.
Pour préparer la solution de collagène pour l’encapsulation, avoir tous les réactifs sur une glacière dans la hotte. Ensuite, prenez 75 microlitres du collagène d’origine. Le collagène est très visqueux, donc lentement absorbé avec la pipette, puis distribuer dans un tube de microcentrifuge sur de la glace.
Prenez 13,85 microlitres de RPMI et ajoutez-les au collagène dans le tube falcon. Ensuite, prenez 10 microlitres de rouge de phénol et ajoutez au mélange sur de la glace et ressuscitez. Enfin, prenez 1,15 microlitres d’un NaOH normal et ajoutez à la suspension pour neutraliser.
Ensuite, prenez une pointe de pipette de 200 microlitres et ressuscitez la suspension. La prochaine étape est l’encapsulation des cellules dans le metrogel de collagène. Ensuite, prenez une partie aliquote de huit microlitres de MC et ajoutez-la à un tube Falcon frais sur la glace.
Ensuite, prenez deux microlitres de CS et ajoutez à ce mélange cellulaire. Remettez la suspension cellulaire sous suspension et saisissez 5,6 microlitres de la suspension cellulaire et mettez dans un tube Falcon frais. Ensuite, prenez le collagène que vous venez de préparer, prenez quatre microlitres du collagène, puis prenez 2,4 microlitres de metrogel.
Pipetter le mélange de haut en bas pour assurer une distribution homogène de la suspension d’hydrogel cellulaire. Une fois l’injection de gel préparée, vous pouvez l’insérer dans les appareils. Prenez un nouveau conseil et ressuscitez.
Prenez la boîte de Petri des appareils, insérez la pointe dans le port d’injection et injectez lentement et régulièrement. Vous verrez que le canal de l’appareil se remplit avec la suspension d’hydrogel cellulaire. Une fois l’autre port rempli, arrêtez l’injection et retirez la pointe.
Après l’injection, retournez les appareils avec une pince à épiler et placez à l’intérieur de la plus grande boîte de Petri avec de l’eau dans l’incubateur pendant neuf minutes. Après neuf minutes, sortez les appareils de l’incubateur et retournez-les vers la verticale, puis replacez-les dans l’incubateur pendant neuf minutes supplémentaires pour terminer la polymérisation de l’hydrogel. Il est maintenant temps d’ajouter les médias.
Alors, prenez RMPI plus B27 et insérez la pointe dans le port multimédia et commencez à pousser lentement. Ensuite, faites-le sur le port multimédia opposé. Vous constaterez peut-être que le support n’est pas injecté, vous pouvez donc placer une gouttelette de support sur le dessus du port, puis prendre la pipette et utiliser une pression négative pour tirer le média de l’autre côté.
Donc, vous verrez que les médias commencent à être tirés à travers le canal. Une fois que les médias ont été ajoutés à tous les canaux médiatiques, les appareils seront remis dans l’incubateur à 37 degrés. Le dispositif microfluidique est représenté dans le coin supérieur gauche.
Les jours un, sept, et 14 de la culture sont montrés cette image. Après 14 jours de culture, les cellules doivent se condenser en structures fortement alignées qui se forment autour des micropostes. Des traces du jour 14 sont montrées ici en C de contraction spontanée, ainsi que des images immunofluorescentes d’actine colorée et de tissus tachés de marqueur cardiaque.
Ce qui devrait être vu, ce sont des fibres d’actine fortement alignées qui se forment après 14 jours en culture, ainsi que des sarcomères matures striés parallèles et des jonctions d’espace localisées. Au cours de cette procédure, il est essentiel de conserver tous les matériaux à basse température sur la glace pendant l’injection d’hydrogel cellulaire afin de prévenir la polymérisation prématurée. Les dispositifs microfluidiques doivent être manipulés avec soin, à la fois pendant la fabrication, l’injection et la culture tissulaire prolongée.
Les injections cellulaires doivent être un processus régulier pour s’assurer que l’ensemble du canal s’est rempli rapidement afin d’éviter la polymérisation prématurée ou le dessèchement de l’hydrogel avant l’ajout du support.
