Las enfermedades cardiovasculares siguen siendo la primera causa de muerte en todo el mundo. Los modelos in vitro tradicionales se basan en el cultivo monocapa. Sin embargo, el corazón, específicamente el músculo cardíaco o el miocardio, es complejo en su anisotropía 3D y composición celular.
Por lo tanto, es crítico mejorar la complejidad de la composición del tejido dentro de modelos ines vitro para imitar mejor los componentes celulares y la estructura del miocardio. Aquí en este trabajo, demostramos un protocolo para el desarrollo de un tejido cardíaco humano derivado de células madre maduras 3D dentro de un nuevo dispositivo microfluídico. Este dispositivo incorpora un canal de tejido principal 3D con microposts elípticos innatos que inducen altos grados de alineación de las células cardíacas encapsuladas en hidrogel circundantes.
El canal principal está flanqueado por canales de medios con puertos de inyección que permiten una difusión de nutrientes en todo el tejido. Debido al cuidado requerido en la manipulación de los dispositivos microfluídicos, la representación visual de este protocolo es útil para establecer correctamente el tejido cardiaco 3D dentro de un dispositivo microfluidic con los microposts encajados para la alineación aumentada del tejido. Para disociar el fibroblasto cardíaco humano, primero saque el matraz de la incubadora.
Poner dentro del gabinete de bioseguridad y comenzar a aspirar los medios gastados del matraz. A continuación, tome tres ML de PBS 1X para lavar el matraz. Cierre la tapa y gire el matraz para que el fondo esté recubierto correctamente de PBS.
Aspirar el PBS. Tomar tres MLs de tripsina de 37 grados y añadir al matraz. A continuación, incline el matraz y gire para que el fondo esté completamente recubierto.
Luego poner en la incubadora durante cuatro a seis minutos. Neutralice la tripsina con la MGF3 tomando tres ML y agregándolas al matraz. Pipetear la solución hacia arriba y hacia abajo para desalojar las células que queden en la parte posterior del matraz.
Recoja la suspensión celular en un tubo Falcon de 15 ML. Tome 10 microlitros de la suspensión celular y dispense en un hemocitómetro para contar las células con un microscopio. Centrifugar la suspensión de la célula a 250 G durante cuatro minutos.
Después de la centrifugación, aspirar el sobrenadante teniendo cuidado de no perturbar el pellet celular. Resuspend el pellet de la célula con FGM3 fresco para hacer un deseado 75 millones de células por ml suspensión. Resuspend las células, a continuación, establecer el tubo hacia abajo con una tapa holgadamente ajustado.
Para disociar los cardiomiocitos, saque la placa de la incubadora y aspire el medio. Tome seis ML de PBS y lave los pozos para que haya un ML de PBS en cada pozo. Aspirar el PBS, teniendo cuidado de no molestar a las células unidas a la placa.
Agregue seis ML de trypLE Express calentado para que haya un ML en cada pozo de una placa de seis pozos. Incubar las células con el triptLE durante 10 minutos. Después de 10 minutos, neutralice el trypLE con seis ML de RPMI más B27 más insulina para que esté agregando un ML de RMPI a cada pocillo.
Use una pipeta de ML para recoger la solución y dispararla contra la parte posterior de los pozos para asegurarse de que todas las células se levanten. Recoja la suspensión celular en un tubo Falcon de 15 ML. Centrifugar el tubo a 300 G durante tres minutos.
Después de la centrifugación, aspirar el medio y el trypLE. Este paso es importante para lavar los cardiomiocitos sensibles. Este paso asegura que todo el trypLE se ha ido en la formación de tejido cardíaco 3D.
Resuspend la pelotilla de la célula en cinco MLs de RPMI más B27 más la insulina. Utilice una pipeta de un ML para pipetear la solución hacia arriba y hacia abajo para asegurar una suspensión de celda homogénea. Tome 10 microlitros de la suspensión celular para contar con el hemocitómetro.
Centrifugar las células a 300 G durante tres minutos. Aspirar los medios después de la centrifugación por segunda vez. Agregue la cantidad adecuada de RPMI más B27 más insulina para lograr una suspensión de 75 millones de células por ML, luego resuspend.
Para preparar la solución de colágeno para la encapsulación, tenga todos los reactivos en una caja de hielo en la campana. Luego tome 75 microlitros del colágeno común. El colágeno es muy viscoso, por lo que lentamente se toma con la pipeta, luego dispensar en un tubo de microcentrífuga en el hielo.
Tome 13,85 microlitros de RPMI y añádalos al colágeno en el tubo Falcon. Luego tomar 10 microlitros de rojo fenol y añadir a la mezcla sobre hielo y resuspend. Por último, tome 1,15 microlitros de un NaOH normal y añadir a la suspensión para neutralizar.
A continuación, tome una punta de pipeta de 200 microlitr y vuelva a suspender la suspensión. El siguiente paso es la encapsulación de las células dentro del metrogel de colágeno. Luego tome una alícuota de ocho microlitros de CMs y agregue a un tubo Falcon fresco sobre hielo.
Luego tome dos microlitros de CS y agregue a esa mezcla celular. Resuspend la suspensión de la célula y agarre 5.6 microlitros de la suspensión de la célula y ponga en un tubo halcón fresco. Luego toma el colágeno que acabas de preparar, toma cuatro microlitros del colágeno, luego toma 2.4 microlitros de metrogel.
Pipetear la mezcla hacia arriba y hacia abajo para asegurar una distribución homogénea de la suspensión de hidrogel de la célula. Una vez que la inyección de gel está preparada, puede insertar en los dispositivos. Tome una nueva punta y resuspend.
Tome la placa de Petri de los dispositivos, inserte la punta en el puerto de inyección e inyecte lenta y constantemente. Verás como el canal del dispositivo se llena con la suspensión de hidrogel de la célula. Una vez que se llene el otro puerto, detenga la inyección y retire la punta.
Después de la inyección, voltee los dispositivos con pinzas y colóquelo dentro de la placa de Petri más grande con agua en la incubadora durante nueve minutos. Después de nueve minutos, saque los dispositivos de la incubadora y voltee en posición vertical, luego vuelva a colocar en la incubadora durante nueve minutos más para completar la polimerización por hidrogel. Ahora es el momento de agregar los medios.
Por lo tanto, tome RMPI más B27 e inserte la punta en el puerto de medios y comience a empujar lentamente. A continuación, hágalo en el puerto de medios opuesto. Usted puede encontrar que el medio no está inyectando, por lo que puede poner una gota de medios en la parte superior del puerto y luego tomar la pipeta y utilizar la presión negativa para tirar de los medios a través del otro lado.
Así que verás como los medios comienzan a ser arrastrados a través del canal. Una vez que los medios se han agregado a todos los canales de medios, los dispositivos se volverán a colocar en la incubadora a 37 grados. El dispositivo microfluídico se muestra en la esquina superior izquierda.
Los días uno, siete y 14 de la cultura se muestran esta imagen. Después de 14 días de cultivo, las células deben condensarse en estructuras altamente alineadas que se forman alrededor de los microposts. Los rastros del día 14 se muestran aquí en C de la contracción espontánea, así como imágenes inmunofluorescentes de la actinina manchada y de los tejidos manchados marcador cardiaco.
Lo que se debe ver son fibras de actina altamente alineadas que se forman después de 14 días en cultivo, así como sarcómeros maduros estriados paralelos y uniones de brecha localizadas. Durante este procedimiento, es fundamental mantener todos los materiales a bajas temperaturas en el hielo durante la inyección de hidrogel celular para prevenir la polimerización prematura. Los dispositivos microfluídicos deben manejarse con cuidado, tanto durante la fabricación, inyección y cultivo de tejidos extendidos.
Las inyecciones celulares deben ser un proceso constante para garantizar que todo el canal se haya llenado mientras se realiza rápidamente para evitar la polimerización prematura o el secado del hidrogel antes de la adición de medios.
