심혈관 질환은 전 세계적으로 사망의 첫 번째 원인으로 남아 있습니다. 전통적인 체외 모델은 단층 문화에 의존합니다. 그러나 심장, 특히 심장 근육 이나 심근은 3D 이소트로피 및 세포 구성에서 복잡합니다.
따라서, 체외 모델 내의 조직 조성의 복잡성을 개선하는 것이 중요하며 세포 성분과 심근의 구조를 더 잘 모방한다. 여기서, 우리는 새로운 미세 유체 장치 내에서 3D 성숙한 줄기 세포 유래 인간 심장 조직의 개발을 위한 프로토콜을 보여줍니다. 이 장치는 주변 하이드로겔 캡슐화 심장 세포의 높은 수준의 정렬을 유도하는 타고난 타원형 마이크로 포스트가있는 3D 주요 조직 채널을 통합합니다.
메인 채널은 조직 전체에 영양 확산을 가능하게 하는 사출 포트와 미디어 채널에 의해 측면. 미세 유체 장치를 처리하는 데 필요한 치료로 인해 이 프로토콜의 시각적 표현은 조직 정렬을 강화하기 위해 내장 된 마이크로 포스트가있는 미세 유체 장치 내에서 3D 심장 조직을 적절하게 확립하는 데 도움이됩니다. 인간의 심장 섬유아세포를 해리하기 위해 먼저 인큐베이터에서 플라스크를 꺼낸다.
생물 안전 캐비닛 내부에 넣고 플라스크에서 소비 된 미디어를 흡인하기 시작합니다. 그런 다음 PBS 1X의 3 개의 ML을 가져 가서 플라스크를 씻으십시오. 캡을 닫고 플라스크를 소용돌이어 바닥이 PBS로 적절하게 코팅되도록 합니다.
PBS를 흡인합니다. 37도 트립신의 3M를 가지고 플라스크에 추가합니다. 그런 다음 플라스크를 기울이고 바닥을 완전히 코팅할 수 있도록 소용돌이합니다.
그런 다음 인큐베이터에 4~6분 간 넣습니다. 3개의 ML을 복용하고 플라스크에 추가하여 FGM3로 트립신을 중화시다. 플라스크 뒷면에 남아 있는 셀을 빼내기 위해 용액을 위아래로 피펫합니다.
15 ML 팔콘 튜브에서 셀 서스펜션을 수집합니다. 세포 현탁액의 10 마이크로 리터를 가지고 현미경으로 세포를 계산하기 위해 혈종계에서 분배하십시오. 4 분 동안 250 G에서 세포 현탁액을 원심 분리합니다.
원심 분리 후, 셀 펠릿을 방해하지 않도록 주의되는 슈퍼 나티부를 흡인. ML 서스펜션당 원하는 7,500만 개의 세포를 만들기 위해 신선한 FGM3로 셀 펠릿을 다시 중단합니다. 세포를 다시 중단한 다음 느슨하게 장착 된 캡으로 튜브를 내려 놓습니다.
심근세포를 분리하려면 배양기에서 접시를 꺼내 미디어를 흡인하십시오. PBS의 6M를 가지고 각 우물에 PBS의 하나의 ML이 있도록 우물을 씻어. PBS를 흡인하고, 접시에 부착된 세포를 방해하지 않도록 주의하십시오.
6개의 웰 플레이트의 각 웰에 ML이 1ML이 되도록 따뜻한 트립슬 익스프레스 6M을 추가합니다. 10 분 동안 트립LE로 세포를 배양합니다. 10 분 후, RPMI 플러스 인슐린의 6 MLs와 트립을 중화하여 각 우물에 하나의 RMPI를 추가합니다.
ML 파이펫 하나를 사용하여 용액을 수집하고 우물 뒤쪽에서 폭발하여 모든 셀이 해제되도록 하십시오. 15 ML 팔콘 튜브에서 셀 서스펜션을 수집합니다. 3분 동안 300G에서 튜브를 원심분리합니다.
원심 분리 후, 미디어와 트립플을 흡인. 이 단계는 민감한 심근세포를 세척하는 것이 중요합니다. 이 단계는 모든 트립슬이 3D 심장 조직 형성에서 사라졌음을 보장합니다.
RPMI 플러스 B27 플러스 인슐린의 5개의 MLs에서 세포 펠릿을 다시 중단합니다. 1ML 파이펫을 사용하여 용액을 위아래로 파이펫하여 균일한 셀 서스펜션을 보장합니다. 혈종계로 계산하기 위해 셀 서스펜션의 10 마이크로리터를 복용하십시오.
3분 동안 300G에서 세포를 원심분리합니다. 원심 분리 후 미디어를 두 번째로 흡인시합니다. ML 서스펜션당 7,500만 개의 세포를 달성하기 위해 적절한 양의 RPMI 플러스 B27 플러스 인슐린을 추가한 다음 다시 중단합니다.
캡슐화를 위한 콜라겐 솔루션을 준비하려면 모든 시약을 후드의 아이스박스에 보관하십시오. 그런 다음 주식 콜라겐의 75 마이크로 리터를 가져 가라. 콜라겐은 매우 점성이 있으므로 파이펫으로 천천히 섭취한 다음 얼음 위에 미세 원심 분리 튜브를 분배합니다.
13.85 마이크로리터의 RPMI를 가져 와서 팔콘 튜브의 콜라겐에 추가하십시오. 그런 다음 페놀 레드 10 마이크로 리터를 넣고 얼음에 혼합물을 추가하고 다시 중단하십시오. 마지막으로, 하나의 정상 NaOH의 1.15 마이크로 리터를 가지고 중화현탁액에 추가합니다.
그런 다음 200 마이크로 리터 파이펫 팁을 가지고 서스펜션을 다시 일시 중단합니다. 다음 단계는 콜라겐 메트로겔 내의 세포의 캡슐화이다. 그런 다음 8 개의 마이크로 리터의 알리쿼터를 가져 와서 얼음 위에 신선한 팔콘 튜브를 추가하십시오.
그런 다음 CS의 두 마이크로 리터를 가지고 그 세포 혼합물에 추가합니다. 세포 현탁액을 다시 중단하고 셀 서스펜션의 5.6 마이크로 리터를 잡고 신선한 팔콘 튜브에 넣습니다. 그런 다음 방금 준비한 콜라겐을 잡고 콜라겐의 마이크로리터 4기를 가져 가십시오.
혼합물을 위아래로 피펫하여 셀 하이드로겔 현탁액의 균일한 분포를 보장합니다. 젤 주입이 준비되면 장치에 삽입 할 수 있습니다. 새 팁을 가지고 다시 중단합니다.
장치의 페트리 접시를 가지고, 사출 포트에 팁을 삽입하고, 천천히 꾸준히 주입. 장치 채널이 셀 하이드로겔 서스펜션으로 채워질 때 표시됩니다. 다른 포트가 채워지면 주입을 중지하고 팁을 제거합니다.
주입 후, 핀셋으로 장치를 뒤집어 9 분 동안 인큐베이터에 물로 더 큰 페트리 접시 안에 놓습니다. 9분 후, 장치를 인큐베이터에서 꺼내 똑바로 뒤집은 다음 인큐베이터에 9분 이상 다시 배치하여 하이드로겔 중합화를 완료합니다. 이제 미디어를 추가할 차례입니다.
따라서 RMPI + B27을 가져 와서 용지 포트에 팁을 삽입하고 천천히 밀어 넣기 시작합니다. 그런 다음 반대 미디어 포트에서 그렇게 합니다. 미디어가 주입되지 않는 것을 발견할 수 있으므로 포트 위에 미디어 방울을 넣은 다음 파이펫을 사용하여 부정적인 압력을 사용하여 미디어를 다른 쪽에서 끌어낼 수 있습니다.
따라서 미디어가 채널을 통해 당겨지기 시작하면 표시됩니다. 모든 미디어 채널에 미디어가 추가되면 장치는 37도에서 인큐베이터에 다시 넣습니다. 미세 유체 장치는 왼쪽 상단 모서리에 표시됩니다.
문화의 일 1, 7, 14이 이미지를 표시합니다. 배양 14일 후에, 세포는 마이크로포스트 의 주위에 형성하는 높게 정렬된 구조물로 응축되어야 합니다. 14일째의 흔적은 자연수축의 C뿐만 아니라 액틴 염색 및 심장 마커 염색 조직의 면역 형광 이미지에 여기에 표시됩니다.
볼 수 있는 것은 문화에서 14일 후에 형성되는 고도로 정렬된 액틴 섬유뿐만 아니라 병렬 로스트화된 성숙한 사커메레와 국산화된 갭 접합체입니다. 이 절차 동안, 조기 중합을 방지하기 위해 세포 하이드로겔 주입 중 얼음에 대한 저온에서 모든 재료를 유지하는 것이 중요합니다. 미세 유체 장치는 제조, 주입 및 확장 된 조직 배양 중에 모두주의로 처리해야합니다.
세포 주사는 미디어 첨가 전에 조기 중합 또는 하이드로겔 건조를 방지하기 위해 신속하게 수행되는 동안 전체 채널이 채워지도록 안정적인 과정이어야합니다.
