使用 D11 scFv-碱性磷酸酶融合蛋白和免疫荧光直接检测组织中的异左旋蛋白

异左旋前列腺素与几种疾病有关，尤其是心血管疾病。该协议旨在检测具有D11碱性磷酸酶融合蛋白和免疫荧光的组织中的异左旋蛋白。目前的检测方法价格昂贵，或者需要E-tag的二抗。

找到可靠的二抗很困难，但该方案删除了二抗步骤。将小鼠和人石蜡包埋组织的载玻片浸入二甲苯三次，持续五分钟以使组织脱氧。为了使组织再水化，用95%乙醇洗涤组织两次，然后用70%乙醇洗涤两次，然后用在水中制备的50%乙醇洗涤两次。

用 TBST 填充载玻片支架，用 0.1% 吐温 20 在三缓冲盐水中洗涤载玻片三次。然后丢弃 TBST。将载玻片置于预热的柠檬酸钠缓冲液中，并在高压下孵育至4分钟的压力锅中，总抗原修复时间为20分钟。

在孵育结束时，从压力锅中取出载玻片，并让它们在室温下冷却20分钟。如图所示，用TBST对载玻片进行三次快速清洗。通过添加溶解在TBST中的2%BSA来阻止载玻片。

用石蜡带覆盖载玻片，并在室温下孵育15分钟。孵育后，丢弃封闭缓冲液。将200微升在TBST中制备的D11碱性磷酸酶加入载玻片中，并用石蜡胶带覆盖载玻片。

在室温下将载玻片在加湿室中孵育三小时后，用TBST洗涤载玻片三次。使用用于免疫组织化学的量热碱性磷酸酶显影剂或用于免疫荧光的荧光碱性磷酸酶显影剂冲洗载玻片。用TBST清洗载玻片一次，以去除多余的显影剂并防止进一步显色。

用在PBS中制备的每毫升HEX核染色剂对载玻片进行复染，以进行免疫荧光。然后用TBST清洗载玻片一次，以去除任何多余的复染。使用安装介质将盖玻片放在显影的载玻片上。

在用于免疫组织化学的倒置光学显微镜或用于免疫荧光的共聚焦荧光显微镜下观察载玻片。可以进行四个阴性对照实验来确认D11 AP染色对异左旋前列腺素的特异性。在第一个阴性对照实验中，用TBST稀释的D11 AP孵育组织，或单独TBST。

然后用稀释的D11 AP和在没有D11 AP接头的情况下稀释的TBST中的细菌壁质提取物孵育组织。对于竞争性测定，以八比一的摩尔比制备加合到小鼠血清白蛋白中的isoLG和isoLG。在 TBST 中稀释 D11 AP 1 至 10。

然后将稀释的 D11 AP 与每毫升 50 微克的异左肝兰素加合 MSA 或非加合的 MSA 在室温下孵育一小时。将含有异左肝素 MSA 的 D11 AP 或含有非内收 MSA 的 D11 AP 添加到组织中进行染色。使用相关的单链片段可变抗体D20对组织进行染色，以获得最终的阴性对照组。

使用该协议研究高血压和正常血压小鼠主动脉的免疫荧光。用D11 AP染色表明与对照小鼠相比，血管紧张素II诱导的高血压小鼠主动脉中isoLGs的浓度增加。D11 AP用于检测人类高血压患者和正常血压人类肠道组织中存在的异左旋前列腺素。

高血压患者的组织具有升高的异左肝素浓度。组织用壁质提取物染色，没有D11 AP。与壁质提取物染色的组织相比，在用D11 AP染色的组织中观察到更明亮的染色，证实染色不是由于壁质提取物中存在的非结合细菌碱性磷酸酶。在竞争性测定中，用 D11 AP 染色的组织与 isoLG 竞争物预孵育显示出染色减少，类似于在具有 D11 AP 的组织中观察到的染色，这表明 D11 AP 对异左旋前列腺素具有特异性。

在阴性对照中，与D20相比，用D11 AP染色小鼠主动脉导致强染色，表明D11 AP对高血压主动脉中异左旋前列腺素的特异性。灭活组织中存在的任何内源性碱性磷酸酶以限制背景染色非常重要。