Las isolevuglandinas han sido implicadas en varias enfermedades, particularmente enfermedades cardiovasculares. Este protocolo fue desarrollado para detectar isolevuglandinas en tejidos con proteína de fusión fosfatasa alcalina D11 e inmunofluorescencia. Los métodos actuales de detección son caros o requieren un anticuerpo secundario para una etiqueta E.
Encontrar un anticuerpo secundario confiable es difícil, pero este protocolo elimina el paso del anticuerpo secundario. Sumerja los portaobjetos de tejidos incrustados en parafina de ratón y humano en xileno tres veces durante cinco minutos para despararafinizar los tejidos. Para rehidratar el tejido, lave los tejidos dos veces con etanol al 95%, seguido de dos lavados con etanol al 70% y luego dos veces con etanol al 50% preparado en agua.
Lave las diapositivas en solución salina tamponada con tris con 0,1%Tween 20 tres veces llenando el portaportaobjetos con TBST. A continuación, deseche el TBST. Coloque los portaobjetos en un tampón de citrato de sodio precalentado e incube en una olla a presión a presión de cuatro minutos a alta presión, para un tiempo total de recuperación de antígenos de 20 minutos.
Al final de la incubación, retire los portaobjetos de la olla a presión y déjelos enfriar durante 20 minutos a temperatura ambiente. Dé tres lavados rápidos a las diapositivas con TBST como se demuestra. Bloquee las diapositivas agregando 2% BSA disuelto en TBST.
Cubra los portaobjetos con cinta de parafina e incube a temperatura ambiente durante 15 minutos. Después de la incubación, deseche el búfer de bloqueo. Agregue 200 microlitros de fosfatasa alcalina D11 preparada en TBST a los portaobjetos y cubra los portaobjetos con cinta de parafina.
Después de incubar los portaobjetos en una cámara humidificada durante tres horas a temperatura ambiente, lave los portaobjetos tres veces con TBST. Desarrolle los portaobjetos con un revelador de fosfatasa alcalina calorimétrica para inmunohistoquímica, o un desarrollador de fosfatasa alcalina fluorescente para inmunofluorescencia. Lave las diapositivas una vez con TBST para eliminar el exceso de revelador y evitar un mayor desarrollo del color.
Contrarrestar los portaobjetos con un microgramo por mililitro de tinción nuclear HEX preparada en PBS para inmunofluorescencia. Luego lave las diapositivas una vez con TBST para eliminar cualquier exceso de contramancha. Utilice el medio de montaje para colocar el cubreobjetos en las guías desarrolladas.
Observe los portaobjetos bajo un microscopio de luz invertida para inmunohistoquímica, o un microscopio fluorescente confocal para inmunofluorescencia. Se pueden realizar cuatro experimentos de control negativo para confirmar la especificidad de la tinción D11 AP para isolevuglandina. En el primer experimento de control negativo, incubar los tejidos con D11 AP diluido en TBST, o TBST solo.
Luego incubar los tejidos con D11 AP diluido y extracto pariplásmico bacteriano diluido en TBST sin el enlazador D11 AP. Para el ensayo competitivo, prepare isoLG e isoLG aducidos a albúmina sérica de ratón en una proporción molar de ocho a uno. Diluir D11 AP uno a 10 en TBST.
Luego incubar el AP D11 diluido con 50 microgramos por mililitro de MSA aducido por isolevugglandina, o MSA no aducido durante una hora a temperatura ambiente. Agregue D11 AP con isolevugglandina MSA o D11 AP con MSA no aducido a los tejidos para la tinción. Utilice un anticuerpo variable D20 de fragmento de cadena única relevante para teñir los tejidos para el conjunto de control negativo final.
La inmunofluorescencia de la aorta en ratones hipertensos y normotensos se estudió utilizando este protocolo. La tinción con D11 AP indicó un aumento de la concentración de isoLGs en la aorta de ratones con hipertensión inducida por angiotensina II en comparación con los ratones control. El D11 AP se utilizó para detectar las isolevuglandinas presentes en los tejidos intestinales de pacientes humanos con hipertensión y humanos normotensos.
Los tejidos de los pacientes con hipertensión tenían concentraciones elevadas de isolevuglandinas. Los tejidos fueron teñidos con extracto pariplásmico y sin D11 AP. La tinción más brillante se observó en el tejido teñido con D11 AP en comparación con el tejido teñido con extracto pariplásmico, confirmando que la tinción no se debió a la fosfatasa alcalina bacteriana no conjugada presente en el extracto pariplásmico. En el ensayo competitivo, el tejido teñido con D11 AP pre-incubado con el competidor isoLG mostró una tinción disminuida, similar a la tinción observada en tejidos con D11 AP, que muestra especificidad de D11 AP a isolevuglandinas.
En el control negativo, la tinción de la aorta del ratón con D11 AP resultó en una tinción fuerte en comparación con D20, lo que indica la especificidad de D11 AP a isolevuglandinas en la aorta hipertensa. Es importante inactivar cualquier fosfatasa alcalina endógena presente en el tejido para limitar la tinción de fondo.
