密度梯度超速离心研究哺乳动物细胞内吞循环

该协议有助于从转染的哺乳动物细胞中分离出含有部分的回收内体，以促进通过内吞细胞运输的蛋白质运输的研究。该技术易于处理，适用于组织和细胞样品。演示该程序的将是来自劳博士实验室的博士生翟宇琪小姐。

首先，在100毫米培养皿中将2倍10到6个细胞。第二天，根据制造商的说明用脂质酸转染细胞。要收获细胞，转染后48小时丢弃培养基，并用冰冷的PBS洗涤细胞两次。

然后向每道菜中加入一毫升冰冷的PBS，并辅以0.5X蛋白酶抑制剂混合物和0.5X磷酸酶抑制剂混合物。接下来，使用细胞刮刀，收集细胞并将细胞悬浮液转移到15毫升离心管中。使用摆动斗式转子离心细胞。

弃去上清液并将细胞沉淀轻轻地重悬于五毫升的均质缓冲液中。通过离心再次收集细胞，并将细胞沉淀重悬于一毫升均质缓冲液中。使用Dounce均质机使用15至20次笔程使细胞均质化。

然后将同源物转移到两毫升离心管中。向均质液中加入700微升均质缓冲液。然后旋转稀释的同源物并收集1.5毫升的上清液。

再次旋转收集的上清液，然后收集1.4毫升的上清液并将其标记为核后上清液。为了制备密度梯度柱，将1.2毫升核后上清液转移到超速离心管中。然后向样品中加入一毫升62%蔗糖溶液，并通过轻柔移液充分混合。

接下来，在样品顶部小心地加入3.3毫升35%蔗糖溶液，然后在35%蔗糖溶液的基础上加入2.2毫升25%蔗糖溶液。最后，用均质缓冲液将超速离心管填充到顶部。离心密度梯度柱，从梯度的顶部开始，小心地收集12个馏分，每个馏分1毫升。

接下来，用一毫升稀释缓冲液稀释所有馏分并离心稀释的样品。离心后，吸出上清液并加入50微升1X样品缓冲液以收获馏分。在馏分七中检测到回收的内体标记Rab11。

还探测了其他亚细胞标志物，包括β COP，COX IV，GAPDH，EEA1，Rab 7和Lamp1。在Squater seven中也检测到阳性EEA1信号。此处显示了 GAPDH、Cox IV 和 Rab11 在 Fraction 7 和核后上清液中测得的条带强度。

用ELMO1，ELMO1 ARF6Q67L或ELMO1 ARF6Q67L FE65转译HEC293细胞后，在ARF6Q67L和FE65过表达的ELMO1分布中没有发现变化。比较不同转染者之间第七部分的ELMO1水平，发现在ARF6Q67L共转染后升高。当ARF6Q67L和FE65共同表达时，观察到进一步增加。

相反，敲除FE65降低了ARF6介导的Elmo1在馏分七中的富集。获得的分数可用于后续分析。例如，蛋白质印迹以可视化部分中的蛋白质水平变化。