Ce protocole aide à isoler les endosomes de recyclage contenant une fraction des cellules de mammifères transfectées afin de faciliter l’investigation du trafic de protéines via le trafic endocytaire. Cette technique est facile à manipuler et applicable aux échantillons de tissus et de cellules. La démonstration de la procédure sera assurée par Mlle Zhai Yu Qi, doctorante du laboratoire du Dr Lao.
Pour commencer, plaquer 2 fois 10 aux 6 cellules dans une boîte de culture de 100 millimètres. Le lendemain, transfectez les cellules avec lipofectamine selon les instructions du fabricant. Pour récolter les cellules, jetez le milieu de culture 48 heures après la transfection et lavez les cellules deux fois avec du PBS glacé.
Ajoutez ensuite un millilitre de PBS glacé complété par un cocktail d’inhibiteurs de protéase 0,5X dans un cocktail d’inhibiteurs de phosphatase 0,5X à chaque plat. Ensuite, à l’aide d’un grattoir à cellules, collectez les cellules et transférez la suspension cellulaire dans un tube de centrifugeuse de 15 millilitres. les cellules par centrifugation à l’aide d’un rotor à godet oscillant.
Jetez le surnageant et remettez en suspension doucement la pastille cellulaire dans cinq millilitres de tampon d’homogénéisation. Prélever à nouveau les cellules par centrifugation et remettre en suspension la pastille cellulaire dans un millilitre de tampon d’homogénéisation. Homogénéiser les cellules avec un homogénéisateur Dounce en utilisant 15 à 20 coups.
Transférez ensuite l’homogonate dans un tube de centrifugation de deux millilitres. Ajouter 700 microlitres de tampon d’homogénéisation à l’homogonate. Ensuite, faites tourner l’homogonate dilué et collectez 1,5 millilitre du surnageant.
Faites tourner à nouveau le surnageant collecté, puis collectez 1,4 millilitre du surnageant et étiquetez-le comme surnageant post-nucléaire. Pour préparer la colonne de gradient de densité, transférer 1,2 millilitre du surnageant post-nucléaire dans un tube ultracentrifuge. Ajoutez ensuite un millilitre de solution de saccharose à 62% à l’échantillon et mélangez bien par pipetage doux.
Ensuite, ajoutez soigneusement 3,3 millilitres de solution de saccharose à 35% sur le dessus de l’échantillon, suivis de 2,2 millilitres de solution de saccharose à 25% sur la solution de saccharose à 35%. Enfin, remplissez le tube d’ultracentrifugation jusqu’au sommet avec un tampon d’homogénéisation. Centrifugez la colonne de gradient de densité et collectez soigneusement 12 fractions de 1 millilitre chacune, en commençant par le haut du gradient.
Ensuite, diluez toutes les fractions avec un millilitre de tampon de dilution et centrifugez les échantillons dilués. Après centrifugation, aspirer le surnageant et ajouter 50 microlitres de tampon d’échantillon 1X pour récolter les fractions. Le marqueur d’endosomes de recyclage Rab11 a été détecté dans la fraction sept.
D’autres marqueurs subcellulaires, notamment le bêta COP, la COX IV, le GAPDH, l’EEA1, le Rab 7 et le Lamp1 ont également été sondés. Un signal EEA1 positif a également été détecté dans la fraction sept. Les intensités de bande mesurées de GAPDH, Cox IV et Rab11 dans la fraction sept et le surnageant post-nucléaire sont montrées ici.
Après avoir transecté des cellules HEC293 avec ELMO1, ELMO1 ARF6Q67L ou ELMO1 ARF6Q67L FE65, aucun changement n’a été trouvé dans la distribution d’ELMO1 avec une surexpression d’ARF6Q67L et FE65. Le taux d’ELMO1 dans la fraction sept a été comparé entre différentes transfections et s’est avéré élevé après la cotransfection d’ARF6Q67L. Une autre augmentation a été observée lorsque ARF6Q67L et FE65 ont été co-exprimés.
Inversement, l’élimination de FE65 a diminué l’enrichissement en Elmo1 médié par ARF6 dans la fraction sept. La fraction obtenue pourrait être utilisée pour une analyse ultérieure. Par exemple, le western blotting pour visualiser les changements de niveau de protéines dans la fraction.
