Dieses Protokoll hilft bei der Isolierung der Recycling-Endosomen, die eine Fraktion aus transfizierten Säugetierzellen enthalten, um die Untersuchung des Proteintransports über den endozytären Handel zu erleichtern. Diese Technik ist einfach zu handhaben und sowohl auf Gewebe- als auch auf Zellproben anwendbar. Das Verfahren wird Miss Zhai Yu Qi, eine Doktorandin aus dem Labor von Dr. Lao, demonstrieren.
Um zu beginnen, Teller 2 mal 10 zu den 6 Zellen in einer 100 Millimeter Kulturschale. Am nächsten Tag transfizieren Sie die Zellen mit Lipofectamine gemäß den Anweisungen des Herstellers. Um die Zellen zu ernten, verwerfen Sie das Kulturmedium 48 Stunden nach der Transfektion und waschen Sie die Zellen zweimal mit eiskaltem PBS.
Dann fügen Sie einen Milliliter eiskaltes PBS, ergänzt mit einem 0,5-fachen Protease-Inhibitor-Cocktail in einem 0,5-fachen Phosphatase-Inhibitor-Cocktail, zu jedem Gericht hinzu. Als nächstes sammeln Sie die Zellen mit einem Zellschaber und übertragen sie die Zellsuspension in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. die Zellen durch Zentrifugation mit einem Schwenklöffelrotor.
Entsorgen Sie den Überstand und resuspenieren Sie das Zellpellet vorsichtig in fünf Milliliter Homogenisierungspuffer. Sammeln Sie die Zellen erneut durch Zentrifugation und resuspen Sie das Zellpellet in einem Milliliter Homogenisierungspuffer. Homogenisieren Sie die Zellen mit einem Dounce Homogenisator mit 15 bis 20 Schlägen.
Dann übertragen Sie das Homogonat auf ein zwei Milliliter Zentrifugationsrohr. Fügen Sie dem Homogonat 700 Mikroliter Homogenisierungspuffer hinzu. Dann das verdünnte Homogonat drehen und 1,5 Milliliter des Überstandes sammeln.
Drehen Sie den gesammelten Überstand erneut, sammeln Sie dann 1,4 Milliliter des Überstandes und kennzeichnen Sie ihn als postnuklearen Überstand. Um die Dichtegradientenkolonne vorzubereiten, werden 1,2 Milliliter des postnuklearen Überstands in ein Ultrazentrifugenrohr überführt. Dann fügen Sie einen Milliliter 62% Saccharoselösung in die Probe und mischen Sie gut durch sanftes Pipettieren.
Als nächstes werden vorsichtig 3,3 Milliliter 35% Saccharoselösung auf die Probe gegeben, gefolgt von 2,2 Millilitern 25% Saccharoselösung zusätzlich zu der 35% Saccharoselösung. Zum Schluss füllen Sie das Ultrazentrifugenröhrchen nach oben mit Homogenisierungspuffer. Zentrifugieren Sie die Dichtegradientensäule und sammeln Sie vorsichtig 12 Fraktionen von je 1 Milliliter, beginnend von der Oberseite des Gradienten.
Als nächstes verdünnen Sie alle Fraktionen mit einem Milliliter Verdünnungspuffer und zentrifugieren Sie die verdünnten Proben. Nach der Zentrifugation den Überstand absaugen und 50 Mikroliter 1X Probenpuffer hinzufügen, um die Fraktionen zu ernten. Der Recycling-Endosomenmarker Rab11 wurde in Fraktion sieben nachgewiesen.
Andere subzelluläre Marker, einschließlich Beta COP, COX IV, GAPDH, EEA1, Rab 7 und Lamp1, wurden ebenfalls untersucht. Ein positives EEA1-Signal wurde auch in Fraktion sieben nachgewiesen. Die gemessenen Bandenintensitäten von GAPDH, Cox IV und Rab11 sowohl in Fraktion sieben als auch im postnuklearen Überstand sind hier dargestellt.
Nach der Transektion von HEC293-Zellen mit ELMO1, ELMO1 ARF6Q67L oder ELMO1 ARF6Q67L FE65 wurden keine Veränderungen in der ELMO1-Verteilung mit ARF6Q67L- und FE65-Überexpression gefunden. Der ELMO1-Spiegel in Fraktion sieben wurde zwischen verschiedenen Transfektionen verglichen und nach Cotransfektion von ARF6Q67L erhöht befunden. Ein weiterer Anstieg wurde beobachtet, wenn sowohl ARF6Q67L als auch FE65 gemeinsam exprimiert wurden.
Umgekehrt verringerte das Ausschalten von FE65 die ARF6-vermittelte Elmo1-Anreicherung in Fraktion sieben. Die erhaltene Fraktion könnte für die anschließende Analyse verwendet werden. Zum Beispiel Western Blotting, um Proteinspiegeländerungen in der Fraktion zu visualisieren.
