该协议为从整个组织标本中提取和分离小细胞外囊泡提供严格且可重复的技术，用于下游外活分析。在目前可实现的纯度最高水平之一，这种方法有助于直接形态学，免疫性，和深表分泌到各种组织标本，包括肿瘤。在这里，我们演示了从脑和肺肿瘤标本中分离组织 EV。
然而，这项技术也可以应用于使用多样化、良性或其他肿瘤标本的研究。首先，在冬眠-E培养基中为每0.4至1.0克组织准备10毫升分离缓冲液。在50毫升管中将整个新鲜或冷冻组织加入缓冲液中，在37摄氏度的温水浴中孵育20分钟。
在此之后，添加蛋白酶和磷酸酶抑制剂，在分离缓冲液中进行最终1倍浓度。将溶液与组织倒入松动的软质均质器中。每个样品使用大约 30 次慢冲程轻轻地分离组织。
然后，将分离的组织和缓冲液转移到50毫升锥形管中。在500x g和4摄氏度下离心5分钟，使细胞和剩余的纤维或有凝聚力的组织碎片产生颗粒。将上清液转移到一个干净的50毫升锥形管中，在2000xg和4摄氏度下离心10分钟，以颗粒和丢弃大型细胞碎片。
将这种上清液转移到一个干净的50毫升圆锥管中，在10000xg和4摄氏度下离心40分钟，以产生任何不需要的较大囊泡或小凋亡体。通过0.45微米过滤器将上清液放入干净的12毫升超离心管中。接下来，超离离样品在10万xg和4摄氏度两个小时，以颗粒小电动汽车。
除上经剂，使超离心管倒置 5 至 10 分钟，频繁敲击以去除管两侧的任何残留液体。然后，将 EV 颗粒重新在 1.5 毫升 0.25 摩尔蔗糖缓冲液中重新填充。用 Parafilm 盖住管子，然后将 EV 旋涡进入溶液中。
在室温下摇动超离心管 10 至 15 分钟。然后再次漩涡。以低于 1，000x g 的速度短暂离车管，以回收管底的液体悬浮液。
如果需要，请将悬挂温度在四摄氏度。首先，在含有 EV 的蔗糖三叶醇缓冲液的 1.5 毫升中加入 1.5 毫升 60%碘糖醇，以创建含有 30%碘糖醇的最终溶液。上下移液多次，将溶液彻底混合。
将溶液转移到 5.5 毫升超离心管的底部。接下来，将 60%碘糖醇库存与超纯水混合，以准备至少 1.5 毫升的 20% 和 10% 碘沙醇溶液。使用注射器和 18 量表针，测量 20%碘糖醇溶液的 1.3 毫升，并小心地将它分层在底部梯度的顶部。
保持针头的斜面与管内接触，就在半月板的上方，并添加溶液滴明智，以避免在密度界面混合层。然后，使用同样的技术，在20%层顶部对10%碘糖醇溶液的1.2毫升进行分层。小心地平衡超离心管，将输转管装入转子铲斗中。
将回转桶转子的加速和减速速度设定为最低速率，并在 268，000x g 和 4 摄氏度下离心 50 分钟。当样品离心时，为每个样品贴上10个1.5毫升微离心管的标签，这些微离心管与密度梯度的一到10的分数相对应。离心完成后，轻轻地从转子铲斗中取出管子，并将其放入稳定的支架中。
移液 10 串行分数 490 微升从梯度的顶部到相应的管。使用折射计测量分数的折射率。然后，将每个分数转移到一个干净的12毫升超离心管。
在每个管中加入5毫升1x PBS，然后缓慢地上下移液器混合。在管顶部再加入六毫升 1x PBS，然后小心再混合。超离心管在10万xg和4摄氏度，以重新颗粒的小囊泡。
去清液，然后轻敲管子，然后将囊泡拉干，进行蛋白质分析或重新切除子宫内进行形态分析。为了对EV进行蛋白质分析，在EV颗粒中加入40微升含有蛋白酶抑制剂的强解解缓冲液。将 Parafilm 放在每个管子上，并大力旋转。
接下来，在室温下摇动管子20分钟，并再次旋转。将样品以1000xg快速离心30至60秒，以恢复整个样品体积。将每个样品转移到新的 1.5 毫升微离心管中，并将其储存在 20 至 80 摄氏度的温度下，直到准备进一步处理。
要准备纯化的乳酸盐进行免疫布洛特分析，在样品中加入5倍Laemmli样品缓冲液，最终浓度为1倍。将样品在95摄氏度下煮5至10分钟。然后，将一到 10 的等量分数加载到 10% SDS 页面凝胶中。
加载等量的组织同质化。执行电泳和西印迹分析，确认纯化的解毒物中的EV蛋白，并比较分数中的相对EV丰度。在这项研究中，从整个组织中提取和纯化细胞外囊泡。
在10至30%碘沙醇梯度的超离心化后，可以看到光 EV 的迁移量高达第二位，而根据组织类型，可以看到密集 EV 的迁移量迁移至第 5 部分。梯度分数的代表性免疫扩散在分数五中表现出小肿瘤衍生 EV 的高效分离和纯化。值得注意的是，与以前从整个脑组织采集的光 EV 相比，肺肿瘤标本在密集的 EV 中显得丰富。
具有代表性的纳米粒子跟踪分析和电子显微镜组织衍生囊泡在主要囊泡包含分数证明整个囊泡的浓缩和保存。与已知尺寸和结构一致的小型 EV。间向性电动汽车是开发新型诊断或预后生物标志物测定的有希望的目标。
该技术为研究人员提供了提取和纯化囊泡的工具，用于下游实用。提取完整或裂解组织 EV 后，可对囊泡进行广泛表征，包括蛋白质组、基因组和唇部分析。此外，示例可用于更有针对性的方法。
直接从组织标本中分离的囊泡可以进一步洞察疾病机制，包括肿瘤发生，并可能在未来提供重要的诊断或预测工具。
