このプロトコルは、感染した哺乳類細胞からの分画を含むリサイクルエンドソームを分離し、エンドサイト人身売買によるタンパク質の密売の調査を容易にするのに役立ちます。この技術は扱いやすく、組織および細胞サンプルの両方に適用可能である。この手順のデモンストレーションは、ラオス博士の研究室の博士課程の学生、ミス・ザイ・ユー・チーです。
まず、100ミリメートル培養皿中の6細胞に2回10を10回プレートする。翌日, メーカーの指示に従ってリポフェクタミンで細胞をトランスフェクト.細胞を収穫するために、培養後48時間培養液を廃棄し、氷冷PBSで細胞を2回洗浄する。
その後、各皿に0.5Xホスファターゼ阻害剤カクテルで0.5Xプロテアーゼ阻害剤カクテルを補った氷冷PBSの1ミリリットルを追加します。次に、細胞スクレーパーを用いて、細胞を回収し、細胞懸濁液を15ミリリットル遠心管に移す。スイングバケットローターを用いた遠心分離による細胞。
上清を捨て、細胞ペレットを5ミリリットルの均質化バッファーに穏やかに再懸濁します。遠心分離によって細胞を再び収集し、均質化バッファーの1ミリリットルで細胞ペレットを再懸濁します。15~20ストロークを使用して、Dounceホモジナイザーで細胞を均質化します。
次にホモゴネートを2ミリリットル遠心チューブに移します。ホモゴネートに700マイクロリットルの均質化バッファーを加えます。その後、希釈したホモゴネートを回転させ、上清の1.5ミリリットルを集める。
収集した上清を再び回転させ、1.4ミリリットルの上清を集め、核後上清としてラベルを付けます。密度勾配カラムを作成するには、核後上清の1.2ミリリットルを超遠心チューブに移します。その後、サンプルに62%スクロース溶液の1ミリリットルを追加し、穏やかなピペットによってよく混ぜます。
次に、サンプルの上に35%スクロース溶液の3.3ミリリットルを慎重に加え、35%スクロース溶液の上に2.2ミリリットルの25%スクロース溶液を加えます。最後に、超遠心チューブを均質化バッファーで上部に充填します。密度勾配列を遠心分離し、勾配の上から始めて、それぞれ12分の1ミリリットルを慎重に収集します。
次に、希釈バッファーの1ミリリットルですべての分画を希釈し、希釈したサンプルを遠心分離します。遠心分離後、上清を吸引し、50マイクロリットルの1Xサンプルバッファーを加えて分画を収穫する。リサイクル内粉マーカーRab11は、フラクション7で検出された。
他の細胞下マーカーは、ベータCOP、COX IV、GAPDH、EEA1、ラブ7、およびLamp1を含む、また、プローブされた。正のEEA1シグナルもFraction 7で検出されました。クオーター7とポスト核上清の両方でGAPDH、コックスIV、およびRab11の測定されたバンド強度をここに示します。
ELMO1、ELMO1 ARF6Q67L、またはELMO1 ARF6Q67L FE65のいずれかを有するHEC293細胞を転移した後、ARF6Q67LおよびFE65過剰発現を有するELMO1分布に変化は見つからなかった。フラクション7のELMO1レベルを異なるトランスフェクション間で比較し、ARF6Q67Lのコトランスフェクション後に上昇することが判明した。ARF6Q67LとFE65の両方が共発現した場合、さらなる増加が認められた。
逆に、FE65をノックアウトすると、ARF6仲介Elmo1エンリッチメントが分数7で減少しました。得られた分数は、その後の分析に使用することができます。例えば、分画中のタンパク質レベル変化を可視化するウェスタンブロッティング。
