在细胞堆中生产腺相关病毒载体，用于大型动物模型的临床前研究

该生产AAV病毒载体的方案具有成本效益，可产生高纯度，高滴度，研究级AAV，用于临床前大型动物模型。该技术在细胞培养室中使用贴壁HEK293细胞，这具有时间效率并且较少的动手操作，从而减少了对细胞的破坏。该协议可以极大地帮助基因治疗领域的病毒载体的产生，也可用于生产其他也结合硫酸乙酰肝素的AAV血清型。

首先，当培养物达到80%汇合度时，从培养物中收集HEK293细胞。吸出培养基，然后用三毫升PBS轻轻洗涤细胞培养板。然后吸出PBS并加入三毫升胰蛋白酶。

将板在37摄氏度下孵育两分钟。孵育后，通过将7毫升完整的DMEM加入到板中来中和胰蛋白酶，并将上清液收集在50毫升锥形管中。轻轻倒置管子以确保细胞均匀。

为了确定细胞密度，将10微升细胞样品与10微升台盼蓝混合。并将混合物添加到细胞计数载玻片中，以便在细胞计数器中进行分析。将细胞悬浮液与一升预热的完整DMEM混合以查看培养室。

轻轻旋转腔室以均匀分布细胞。将腔室在37摄氏度下孵育5%的二氧化碳。除细胞培养室外，培养细胞以每百厘米10至第四个细胞的平方放入15厘米的板中作为汇合的参考。

孵育65小时后，当细胞汇合度为80%至90%时，缓慢地将聚乙烯亚胺-DNA和DMEM混合物加入细胞培养室端口。将液体均匀地分布到所有行中，然后在37摄氏度和5%二氧化碳下孵育72小时。孵育后，用力摇动细胞培养室以移开细胞，直到培养基出现浑浊，并将其倒入4或500毫升离心管中。

通过在4摄氏度下以18， 000倍G离心30分钟来沉淀细胞。将澄清的上清液倒入一升PETG瓶中，并将细胞沉淀重悬于500毫升离心管中的50毫升许可缓冲液中。将管子在37摄氏度下孵育60分钟。

孵育后，将试管以18， 000倍G离心30分钟，并将上清液转移到相同的一升PETG瓶中。储存在零下80摄氏度。在四摄氏度下解冻粗裂解物过夜。

解冻后，使用0.22微米过滤器过滤。在纯化步骤之前，通过为所使用的每个肝素 - 琼脂糖柱添加4毫升过滤预处理缓冲液来钝化离心浓缩器。将管道置于蠕动泵中。

按顺序运行解决方案和介质。通过将5毫升肝素 - 琼脂糖柱连接到管子上，并通过柱运行25毫升Bazell DMEM来准备色谱。然后将0.2微摩尔的过滤粗裂解物以每秒一到两滴的流速加载到柱上。

依次洗涤色谱柱，用300毫摩尔氯化钠HBSS洗脱五次，其中镁和钙，并将五个洗脱物标记为E1至E5。准备就绪后，以900倍G旋转含有预处理缓冲液的离心浓缩器两分钟。丢弃流出。用四毫升HBSS用镁和钙洗涤离心浓缩器过滤器，以1000倍G旋转两分钟。

然后将洗脱液E2加入离心浓缩器中，并以1000倍G旋转五分钟。丢弃流出。同样地将洗脱液E3旋转到离心浓缩器中，直到浓缩的病毒约为一毫升。

使用P200过滤的尖端从离心浓缩器中取出浓缩的病毒，并将其收集到无菌的1.5毫升离心管中。收集病毒后，用200微升HBSS镁和钙冲洗离心浓缩器。用力上下移液30秒，以移走粘附在膜上的任何病毒，并将浓缩的病毒收集在同一个1.5毫升离心管中。

将管子混合均匀。洗涤色谱柱并用20%乙醇饱和，然后储存在4摄氏度。将泵管储存在一摩尔氢氧化钠中。

肌内给药后28天比较小鼠，仓鼠和羔羊中AAV6.2FF衣壳的转导效率。小鼠给予每公斤AAV6.2FF人IgG的第12个载体基因组10倍，血清中每毫升人IgG表达171至237微克。仓鼠以每公斤AAV6.2FF人类IgG向第13个载体基因组施用两次10，表达的人类IgG水平远高于小鼠。

而大型动物模型能够在血浆中平均每毫升表达35微克的人类IgG水平。大型动物模型可以确定AAV转基因在体内的表达，并确定转基因是否对感兴趣的疾病或疾病具有治疗作用。该研究展示了AAV6.2FF（骨骼肌中一种新型AAV 6血清型载体）的巨大转导能力，以及AAV病毒载体在体内的低免疫原性。