AAVウイルスベクターの生産のためのこのプロトコルは、費用対効果が高く、前臨床、大規模な動物モデルでの使用のための高純度、高価価物、研究グレードAAVをもたらす。この技術は、細胞培養チャンバーに付着性HEK293細胞を使用し、時間効率が良く、実践的に少なく、細胞への破壊を減らすことを可能にする。このプロトコルは、遺伝子治療の分野のためのウイルスベクター産生に大いに役立ち、またヘパラン硫酸に結合する他のAAV血清型の産生に使用することができる。
開始するには、80%合流に達したときに培養液からHEK293細胞を採取する。PBSを3ミリリットルで細胞培養板を静かに洗浄する前に培地を吸引する。その後、PBSを吸引し、トリプシンの3ミリリットルを追加します。
プレートを摂氏37度で2分間インキュベートします。インキュベーション後、トリプシンを中和し、プレートに完全DMEMの7ミリリットルを加え、50ミリリットル円錐形チューブに上清を集める。細胞が均質であることを確認するために、チューブを穏やかに反転させます。
細胞密度を決定するには、細胞サンプルの10マイクロリットルを10マイクロリットルのトリパンブルーと混合します。そして、セルカウンターで分析するためにセルカウントスライドに混合物を追加します。培養チャンバーを見るために、予め温めた完全なDMEMの1リットルと細胞懸濁液を混合する。
チャンバーをそっと回転させて細胞を均等に分配します。5%の二酸化炭素で37°Cでチャンバーをインキュベートします。細胞培養チャンバーに加えて、培養細胞は10〜4センチメートルの培養細胞を合流性の基準として15センチメートルのプレートに2乗した。
65時間のインキュベーション後、細胞が80〜90%コンフルエントである場合、ポリエチレンイミン-DNAとDMEM混合物を細胞培養チャンバーポートにゆっくりと加える。液体を摂氏37度でインキュベートする前にすべての列に均等に分配し、72時間の二酸化炭素を5%ずつ分配します。インキュベーション後、細胞培養チャンバーを激しく振って、媒体が濁って見えるまで細胞を外し、4または500ミリリットルの遠心分離管に注ぎます。
細胞を摂氏4度で30分間18,000倍Gで遠心分離してペレットする。明確化した上清を1リットルのPETGボトルに注ぎ、500ミリリットル遠心分離管で50ミリリットルの認可されたバッファーで細胞ペレットを再懸濁します。37°Cで60分間チューブをインキュベートします。
インキュベーション後、チューブを18,000倍Gで30分間遠心し、上清を同じ1リットルPETGボトルに移します。マイナス80度で保管してください。粗いライセートを一晩摂氏4度で解凍します。
解凍したら、0.22ミクロンフィルタを使用してフィルタリングします。精製ステップの直前に、使用されている各ヘパリン-セファローズカラムに4ミリリットルのフィルター前処理バッファーを加えて遠心濃縮器をパッシベーションします。チューブを蠕動ポンプに入れる。
ソリューションとメディアを順次実行します。5ミリリットルのヘパリン-セファローズカラムをチューブに取り付け、カラムを通して25ミリリットルのBazell DMEMを実行してクロマトグラフィーの準備をします。その後、濾過された粗いライセートの0.2マイクロモルを1秒あたり1〜2滴の流量でカラムに積み込みます。
カラムを順次洗浄して、塩化ナトリウムHBSSの300ミリモル、マグネシウム、カルシウムで5ミリリットルを5回溶出し、5つの溶出物をE1〜E5とラベル付けします。準備ができたら、前処理バッファーを含む遠心濃縮器を 900 回 G で 2 分間回転させます。フロースルーを破棄します。遠心濃縮器フィルターを4ミリリットルのHBSSでマグネシウムとカルシウムで洗浄し、Gを1000倍2分間回転させます。
次に、遠心濃縮器に溶出E2を加え、Gの1000倍で5分間回転します。フロースルーを破棄します。同様に、溶出E3を遠心濃縮器に回し、濃縮ウイルスが約1ミリリットルになるまで回転させる。
P200フィルターチップを使用して遠心濃縮器から濃縮ウイルスを除去し、滅菌1.5ミリリットル遠心分離管に集める。ウイルスの採取後、遠心濃縮器を200マイクロリットルのHBSSでマグネシウムとカルシウムで洗浄します。ピペットは、膜に付着したウイルスを取り除くために30秒間激しく上下し、同じ1.5ミリリットル遠心管に濃縮ウイルスを集める。
チューブをよく混ぜます。カラムを洗い、摂氏4度で保存する前に20%エタノールで飽和させます。ポンプチューブを1モル水酸化ナトリウムに保管します。
AAV6.2FFカプシドの導入効率を、筋肉内投与時に28日間マウス、ハムスター、およびラムで比較した。マウスは、AAV6.2FFヒトIgGの1キログラム当たり12番目のベクターゲノムに10回10回投与し、血清中のヒトIgGのミリリットル当たり171〜237マイクログラムの間で発現した。ハムスターは、AAV6.2FFヒトIgGの1キログラム当たり13番目のベクターゲノムの2倍10〜13番目のベクターゲノムで投与され、マウスよりもヒトIgGのレベルがはるかに高く発現した。
一方、大型動物モデルは、血漿中のヒトIgGレベルの1ミリリットル当たり平均35マイクログラムを発現することができた。大型動物モデルは、In vivoにおけるAAVトランスジーンの発現を決定し、そして、トランス遺伝子が目的の障害または疾患に対して治療効果を有するかどうかを決定することができる。この研究は、骨格筋における新しいAAV 6血清型ベクターであるAAV6.2FFの偉大な形質導入能力と、生体内でのAAVウイルスベクターの低免疫原性を示した。
